達格列凈預處理對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響*

林 偉 熊尚全 劉 芳 詹 萍 李翠云 林 超 林飛寧

1 福建中醫藥大學附屬人民醫院,福建省福州市 350000; 2 福建醫科大學附屬福州兒童醫院

急性心肌梗死病情危重,及時給予再灌注治療,恢復心肌的血液灌注是治療急性心梗的關鍵措施。再灌注治療可以通過經皮冠狀動脈介入治療(PCI)、冠狀動脈旁路移植術(CABG)和藥物溶栓來完成。然而,再灌注治療會引起心肌缺血—再灌注(I-R)損傷[1-2],加劇心肌細胞的壞死與凋亡。因此,怎樣減少I-R損傷是科學研究的重點。提前給予藥物干預是在缺血預處理的背景上發展起來的,它能激發機體內源性防護機制來對抗I-R 損傷,具有重要的臨床意義。作為一種新型降糖藥物,鈉—葡萄糖協同轉運蛋白2抑制劑(SGLT-2i)發揮重要的作用,該類型藥物包括卡格列凈、達格列凈等,可以對鈉離子等進行重吸收,讓腎小管能夠排出大量的葡萄糖,從而讓機體血液中的葡萄糖水平能夠降低[3]。在讓血糖水平降低的同時該類藥物同時兼有保護腎臟、降血壓、降血脂等作用。其中,以達格列凈為代表,根據相關研究資料可以明確,該類型藥物可以讓復合心血管事件、全因死亡率等得到有效降低。SGLT-2i可促進尿糖的排出,從而降低葡萄糖毒性和體重,并增強利鈉,從而降低血壓,減少心力衰竭患者總病死率,還可對其腎臟疾病的發展產生延緩效果[4-5]。鑒于達格列凈有心血管保護作用,本文以糖尿病大鼠作為樣本,研究達格列凈對心肌I-R損傷的影響,對其作用機制進行探討,為探求保護心肌I-R損傷的臨床藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物:雄性糖尿病(SD)大鼠24只,平均體重270g,均為孚生物技術有限公司提供。選擇購買碧云天公司的TUNEL試劑盒;(2)試劑儀器:購買Meilunbio公司的TTC,Sigma公司的伊文思藍;購買由阿斯利康制藥有限公司生產的達格列凈,批號NH3264。購買Olympus公司CKX-3顯微鏡,購買北京北瑞未來科技有限公司TKR-200C小動物呼吸機。

1.2 方法

1.2.1 分組。實驗動物隨機分3 組,每組8 只:(1)假手術組: 開胸后僅在LAD下穿線不結扎;(2)達格列凈預處理組:在給予結扎之前連續1個月口服給藥,每天給藥1次,根據體重給藥(1mg/kg),隨后結扎LAD,時間為0.5h,2h為灌注時間; (3)I/R組:0.5h為結扎LAD時間,2h為灌注時間,無其他藥物處理。連續監測肢體Ⅱ導聯心電圖,觀察心率及ST段改變,用伊文斯藍等對缺血和梗死面積進行檢測,對心肌細胞AI進行檢測。

1.2.2 模型建立。以參照文獻[6-7]介紹的方法為基礎構建模型,糖尿病SD大鼠經腹腔注射麻醉,仰臥固定四肢與頭部,頸部正中去毛,縱向做一0.5cm切口,暴露出氣管,插入大小合適的氣管套管并接呼吸機(頻率70次/min,潮氣量1.5ml/100g,吸呼比為1∶1.5)。左頸部做一約0.5cm切口,鈍性分離皮下組織,直到露出左側頸靜脈,穿刺左頸靜脈,插入一根靜脈留置針備用并固定。左側胸部第3～4 肋間去除體毛,并做一長約2cm的縱形切口,鈍性分離胸大肌,直到露出肋骨,分離第3或第4肋間肌,再用小型拉鉤分開肋間,以眼瞼撐開器分開并固定,切開心包,徹底暴露心臟,找到肺動脈圓錐和左心耳,在左心耳根部下方約2mm處用8-0 Prolene線穿針通過,穿針深度通過心肌約1mm,進出針眼間距1.5～2mm。采用打活結法,對LAD進行可逆性結扎,讓心肌在0.5h中處于缺血狀態,把絲線解開,繼續2h灌注。開始實驗時將針式電極穿入大鼠四肢皮下,尾部連接到心電圖相對應的肢導聯線上,描記心電圖Ⅱ導聯。以左室前壁出現紫紺或藍紫色,同時心電圖提示ST段抬高0.2mV以上,QRS 幅度變寬升高作為大鼠LAD準確結扎的標準;以ST段回落1/2以上,缺血區紫紺或藍紫色消失作為冠狀動脈再通的標志。操作過程中,如果出現室顫等,或未到時間就死亡的大鼠,就拋棄不用,直至達到實驗目標數。

1.3 觀察指標

1.3.1 生化指標測定。缺血再灌注2h后,從左頸靜脈抽出2ml血,加到促凝管中,在室溫下放置1h,后3 000r/min離心5min,取上層血清,保存在-20℃冰箱中,3～8h內用LDH測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號A020-2-1)、大鼠CK-MB ELISA試劑盒(批號MM-0625R2)對血清相關指標進行檢測。

1.3.2 測定心肌梗死和缺血范圍。完成上述操作之后原位結扎,把伊文氏藍注入靜脈,把非缺血心 肌染成藍色,從而顯示出缺血區心肌。切去除左心室外的心臟其他部分,按垂直于左心室長軸方向做病理切片(厚1～2mm),將其放入pH 7．4,濃度2%的TTC磷酸緩沖液中,孵育,時間為20min,溫度為37℃。紅色區域為非梗死區,灰白色區域為梗死區,對照片進行拍攝,對不同部分的面積進行分析。以危險區面積與左心室面積(LV)的比值(AAR/LV)表示危險區面積;梗死面積為每一心臟總梗死區面積與總危險區面積的比值(AN/AAR)。

1.3.3 原位末端標記(TUNEL)測定凋亡心肌細胞。應用TUNEL法測定缺血區心肌細胞凋亡指數。在進行測試的時候以說明書要求為基礎進行。測定凋亡指數的時候需要對切片陽性細胞視野進行隨機抓拍,對凋亡陽性核的個數及細胞總數進行計算,數據以均數±標準差表示,按細胞凋亡率=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

2 結果

2.1 達格列凈對心肌I/R后CK-MB、LDH的影響 與假術組相比,缺血再灌注后大鼠血清CK-MB、LDH明顯升高;達格列凈組與I-R組相比,心肌酶水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠CK-MB和LDH水平比較

2.2 達格列凈預處理可有效減少MI面積 除假手術組外,各組心肌危險區面積無顯著性差異(P>0.05);與I-R組相比,達格列凈組心肌梗死面積明顯減小(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠心肌梗死面積比較

2.3 達格列凈預處理可有效減少I-R心肌細胞的凋亡 凋亡陽性心肌細胞核呈現棕褐色 ,不規整碎點狀 ,大小形態不一;細胞如果沒有凋亡則具有較大并且藍色的細胞核。凋亡細胞在假手術組很少見(見圖1a);I-R組較多見(見圖1b),AI為(38.5±1.9)%;與I-R組相比,達格列凈組(見圖1c)凋亡細胞相對減少(P<0.05),AI為(28.4±1.4)%。

圖1 大鼠心肌組織切片TUNEL染色(×200)

3 討論

當機體冠狀動脈出現不穩定斑塊破裂等情況并形成血栓的時候可導致該處血管血流中斷,嚴重時可導致心肌發生壞死,在對該類型患者進行治療的時候,再灌注是治療該病的重要手段,它可使缺血心肌組織再次獲得血液灌注,為缺血心肌細胞提供必要的營養成分,恢復其正常的結構和功能。但是,在給予患者該類型治療時部分患者并沒有有效改善缺血性損傷,反而導致損傷進一步加劇[8-9]。本研究結果表明,對比I-R組可以發現,給予其達格列凈預處理可讓損傷得到顯著改善,這是因為該藥物讓乳酸脫氫酶和肌酸激酶同工酶的釋放水平降低,進而可以讓心肌梗死面積顯著減少。

Murry等[10]首先提出了缺血預處理的概念,分析該概念可以明確,其是指利用信號傳導等方式對再灌注損傷進行改善[11],雖然該方式得到一定的認可,但是臨床上并沒有廣泛采用缺血預處理的方式,原因是這種抗損傷機制如果想要形成,首先需要接受缺血預適應損傷,因此導致研究者在對其進行研究和分析的時候選擇使用藥物進行模擬。藥理預處理的優點是操作簡便、無明顯創傷,是一種切實可行的臨床治療策略。武衛黨等人[12]研究表明:在對大鼠心肌功能進行研究和分析的時候,達格列凈可對其產生顯著的改善效果,可讓相關血管與心肌功能得到有效恢復。也有研究的學者認為:患有2型糖尿病的患者往往具有較高的心血管死亡發生概率,同時還具有較高的心力衰竭發生概率。如果給予患者達格列凈治療,這些患者同時出現兩種預后的風險可能會降低[13]。以上研究提示達格列凈可能改善心肌缺血,但能否減輕心肌I-R損傷并不明確,目前這方面研究相對較少,所以本研究以大鼠作為樣本,對和人類類似的心肌缺血再灌注模型進行構建,采用達格列凈預處理的方式,研究其和心肌損傷之間的關系。

SGLT-2i是一類新型的降血糖藥物,它抑制鈉—葡萄糖協同轉運蛋白2的作用機理與以往的降血糖藥物不同,該藥物在發揮作用時可對Na+等產生影響,使其重吸收過程受到阻礙,進而讓腎小管排出大量葡萄糖,讓機體血液中糖水平降低[3]。在降低血糖的過程中使用該藥物同時兼有保護腎臟、降血壓、降血脂等多方面的作用。其中,以達格列凈為代表,能在一定程度上降低糖尿病患者的心血管事件發生概率,該類型藥物在降低血糖與胰島素濃度后,會增加脂肪的分解,促進脂肪酸轉化成酮類,而酮類物質能加快能源的釋放來滿足心肌運動時的能量消耗。SGLT-2i可促使心力衰竭患者的心肌代謝功能的紊亂得到改善,當心肌收縮功能下降時,可降低支鏈氨基酸代謝對丙酮酸利用率的影響和I-R損傷;它能減少肌細胞膜相關交換泵的活性,降低細胞中的Na+水平[14]。該藥物還有正性肌力作用,之所以有該情況出現,可能是因為在機體使用該藥物之后能夠小幅度提升胰高血糖素水平[15]。

對其他研究學者研究成果進行研究和分析,可以發現該藥物通過以下幾個方面發揮作用:(1)抑制鈉氫轉運體(NHE-1)的活性:包括卡格列凈、達格列凈、恩格列凈在內的多種SGLT-2i均已被研究證明可抑制NHE-1活性,從而降低心肌細胞內Na+濃度,減少Na+-Ca2+交換,減輕細胞內的Ca2+負荷,降低鈣超載帶來的損傷[16]。(2)改善線粒體功能:在缺氧情況下,細胞內ATP和氧分壓的下降會導致線粒體氧化磷酸化功能障礙,電子傳遞鏈受損,而SGLT-2i曾被證實可以維持H/R干預下H9c2細胞內的ATP水平,增強細胞活力[17]。(3)調節P13K/AKT信號通路減少細胞凋亡:SGLT-2i被證實可直接將多種細胞系中蛋白激酶(AMPK)Thr172磷酸化,在下游通路中,也可見其對內皮一氧化氮合酶(eNOS)及蛋白激酶(Akt)的磷酸化作用,在缺血損傷模型中,Akt等物質的激活可抑制下游促凋亡蛋白(如Bax等)的表達,從而發揮心肌保護作用[18-19]。

綜上所述,達格列凈預處理可能通過抑制NHE-1的活性,改善線粒體功能,對相關信號通路進行調節,使梗死面積減少,細胞凋亡水平、乳酸和肌酸激酶同工酶水平降低,起到對I-R 心肌的保護作用。