注射用鹽酸頭孢甲肟丁基橡膠塞質量控制研究*

郭勝才，席時東，戴安印，周文威

（1. 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇三醫院，浙江 杭州 310013； 2. 浙江省寧波市藥品檢驗所，浙江 寧波 315000； 3. 浙江省寧波市第二醫院，浙江 寧波 315010）

藥用鹵化丁基橡膠塞呈立體網狀多孔結構，主要成分是生膠，具有良好的彈性、阻隔性、低萃取性，對熱、臭氧和化學品有良好的抗耐性。為確保膠塞符合藥用質量要求，需在膠塞中添加配合劑。配合劑按作用的不同，可分為硫化劑、硫化促進劑、防老劑、填充劑、著色劑及活性劑等［1-4］。硫磺和二硫化四甲基秋蘭姆（下文簡稱秋蘭姆）分別是常用的硫化劑和硫化促進劑，其可使橡膠膠料通過生膠分子間交聯，生成三維網絡結構［1］。抗氧劑可延長膠塞材料的壽命，抑制或延緩膠塞老化，其中2，6 - 二叔丁基- 4 - 甲基苯酚（BHT）是優良的通用型酚類抗氧劑，在橡膠塞的生產中應用廣泛［5］。但配合劑可能存在對人體有害的成分，且影響膠塞與藥物的相容性［2-3］，單質硫和常見抗氧劑可從膠塞遷移至藥品中，因此多國對膠塞中的抗氧劑、硫化劑等有關成分作了限量規定。基于此，本研究中參考2020年版《中國藥典（二部）》和相關文獻［6-15］，建立了同時測定藥用丁基膠塞中單質硫、秋蘭姆和BHT 含量的高效液相色譜（HPLC）法，并將其用于市場上多批膠塞和藥品樣品的檢測，為注射用頭孢甲肟藥品的質量控制和藥品與包材的相容性研究提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器（美國Agilent 公司）；CP225D 型電子分析天平（德國Sartorius 公司，精度為0.001 g）；SB - 5200DTN 型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ST40R型離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 試藥

注射用鹽酸頭孢甲肟（含膠塞）為2018年國家藥品抽檢樣品，其中S1 - S4，S5 - S7，S8 - S9，S10 - S13，S14 - S17，S18 - S20，S21 - S23，S24 - S29 樣品分別由廠家A-H 提供；空白丁基橡膠塞（由廠家A-H 提供，各2 個；分別由廠家I，J，K，K，I，L，L，K 生產，編號分別為I1、I2，J1、J2，K1、K2，K3、K4，I3、I4，L1、L2，L3、L4，K5、K6）；秋蘭姆對照品（批號為stbf1299v，含量97%），BHT 對照品（批號為bcbv3237，含量＞99.0%），均購自德國Merck 公司；單質硫對照品（國藥集團化學試劑有限公司，批號為20170227，含量99.999%）；乙腈為色譜純，二氯甲烷、無水乙醇、三氟乙酸均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido CAPCELL PAK MGⅡC18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：1%三氟乙酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～6 min時30%A，6～26 min時30%A →10%A，26～31min時30%A）；流速：1.0mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20μL。

2.2 溶液制備

分別取秋蘭姆、BHT、單質硫對照品19.40，23.30，10.07 mg，精密稱定，分別置50 mL 容量瓶中，加入二氯甲烷-無水乙醇（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，即得質量濃度分別為388.0，461.3，201.4μg/mL 的單一對照品溶液，各取適量，置同一容量瓶中，稀釋10倍，制成混合對照品溶液。

取藥品粉末或剪碎的空白膠塞樣品2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入二氯甲烷-無水乙醇（1∶1，V/V）10 mL，稱定質量，100 ℃水浴回流3.5 h，放冷，再次稱定質量，用二氯甲烷-無水乙醇（1∶1，V/V）補足減失的質量，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，取濾液，即得供試品溶液或膠塞供試品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取2.2項下對照品溶液和膠塞供試品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果膠塞供試品溶液色譜中，在與對照品溶液相同保留時間處有相應BHT、單質硫色譜峰，理論板數按秋蘭姆峰、BHT 峰、單質硫峰計均大于2 000，保留時間分別為4.389，12.985，23.872 min，各成分峰之間分離良好，分離度均大于2.0。詳見圖1。

線性關系考察：精密量取2.2 項下3 種單一對照品溶液各適量，加入二氯甲烷-無水乙醇（1∶1，V/V）分別稀釋至每1 mL 含BHT 0.46，0.74，0.92，4.61，23.07，46.13，230.67 μg，單質硫0.20，0.32，0.40，2.01，10.07，20.14，100.70 μg，秋蘭姆0.000 2，0.000 3，0.000 5，0.001 0，0.001 9，0.009 7，0.048 5μg的系列單一對照品溶液。取20μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 線性關系及檢測限、定量限考察結果Tab.1 Results of the linear relation test，LOD and LOQ investigation

檢測限與定量限考察：取“線性關系考察”項下的系列單一對照品溶液各適量，稀釋，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以信噪比為10∶1 和3∶1 時的待測成分質量濃度為定量限和檢測限。結果見表1。

精密度試驗：取2.2 項下混合對照品溶液（分別含秋蘭姆0.009 7 μg/ mL，BHT 4.61 μg/ mL，單質硫2.01μg/mL）適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果秋蘭姆、BHT、單質硫峰面積的RSD分別為1.09%，0.46%，1.44%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2 項下混合對照品溶液適量，分別于室溫放置1，9，30 d 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果秋蘭姆、BHT、單質硫保留時間的RSD分別為0.30%，0.60%，0.47%，峰面積的RSD分別為1.94%，1.53%，1.38%（n=3），表明混合對照品溶液在室溫條件下放置30 d內基本穩定。

加樣回收試驗：取已知含量的A廠家膠塞（編號為I1）2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入每1 mL含秋蘭姆0.048μg BHT 23.05μg、單質硫10.07μg的單一對照品溶液4，5，6 mL，按2.2項下方法制備膠塞供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測定

取注射用頭孢甲肟粉末及經剪碎的包材膠塞、空白膠塞樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液及膠塞供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。采用外標法計算待測成分含量，結果見表3 至表5（S0 為日本武田制藥公司所產原研藥，使用覆膜丁基膠塞）；與20 ℃及以下（陰涼庫）存放比較，藥品粉末樣品60 ℃條件下倒置存放5 d 后包材膠塞BHT 含量無顯著變化（t= 1.284，P＞0.05），單質硫含量顯著減少（t=2.928，P＜0.05），詳見表6。以上檢測中均未檢出秋蘭姆。

表3 空白膠塞樣品含量測定結果（μg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of relevant ingredients in blank rubber stoppers（μg/g，n=3）

表4 注射用頭孢甲肟粉末樣品的含量測定結果（μg/g，n=3）Tab.4 Results of content determination of relevant ingredients in Cefmenoxime Hydrochloride for Injection powder（μg/g，n=3）

表5 包材膠塞樣品含量測定結果（μg/g，n=3）Tab.5 Results of content determination of relevant ingredients in packaging rubber stoppers（μg/g，n=3）

表6 60 ℃下倒置5 d后包材膠塞含量測定結果（μg/g，n=3）Tab.6 Results of content determination of relevant ingredients in packaging rubber stoppers after inversion at 60 ℃for 5 d（μg/g，n=3）

3 討論

3.1 色譜條件選擇

預試驗中考察了不同配比的甲醇-水、乙腈-水、乙腈-四氫呋喃-水、乙腈-0.1%三氟乙酸等溶劑作為流動相的分離效果，結果顯示，以乙腈- 0.1%三氟乙酸（90∶10，V/V）為流動相時秋蘭姆、BHT和單質硫的分離效果較好，色譜峰峰形對稱，但秋蘭姆保留時間過短，易受溶劑峰干擾，因此以乙腈- 0.1%三氟乙酸作為流動相時，前6 min 兩者體積比為70∶30，待秋蘭姆出峰后，流動相配比調整為90∶10（V/ V），這樣既可避免溶劑峰對秋蘭姆峰的干擾，又可縮短分析時間，提高分析效率。利用光電二極管陣列檢測器可在線獲得3種待測成分的紫外光譜圖的特點，比較紫外檢測光譜圖，發現在280 nm 波長處3 種待測成分均有較強紫外吸收，故選擇280 nm作為檢測波長。

3.2 提取方式選擇

比較了無水乙醇、乙腈、二氯甲烷、二氯甲烷- 無水乙醇（1∶1，V/V）作為提取溶劑的3 種待測成分的得率，發現二氯甲烷- 無水乙醇（1∶1，V/ V）對BHT 和單質硫的提取更完全，但在膠塞提取試驗中均未檢測到秋蘭姆。另外考察了超聲提取和溶劑回流提取及不同回流時間對待測成分溶出的影響，發現超聲提取不及溶劑回流提取的提取率高，溶劑回流提取3.5 h達最大提取率，延長提取時間不會顯著影響提取結果，因此確定提取時間為3.5 h，但秋蘭姆在加熱回流條件下的加樣回收率較低。

3.3 測定結果分析

本研究結果顯示，所有樣品均未檢出秋蘭姆，可能因為秋蘭姆在丁基橡膠塞生產過程中與其他添加劑發生反應或秋蘭姆類之間發生相互反應，導致其在硫化過程中被消耗殆盡，故檢測不到［1］。秋蘭姆的加樣回收率低于70%，可能還與其熱穩定性較差有關。不同制劑生產廠家提供的空白膠塞和實際樣品使用丁基橡膠塞中BHT 和單質硫的測定結果不一致，批次差異大，說明膠塞生產廠家質量不夠穩定。2 家國內公司與（原研廠家）日本武田制藥公司生產的注射用頭孢甲肟粉末使用覆膜丁基膠塞，其他廠家均使用普通丁基橡膠塞，使用覆膜丁基膠塞的藥品粉末中未檢出BHT 和單質硫。20 ℃及以下存放樣品和60 ℃下倒置5 d 后樣品的丁基橡膠塞中BHT 含量無顯著差異，但單質硫的含量顯著減少，表明溫度對丁基橡膠塞中BHT 的遷移無太大影響，但對單質硫的遷移影響較大，可能有更多的硫遷移到了藥品粉末中，提示藥品應在陰涼庫中保存。個別廠家的藥品粉末樣品中也檢出BHT，但均未檢出單質硫，說明存在BHT向藥品粉末遷移的情況，需要制劑生產廠家對丁基橡膠塞除按現行國家藥品包材標準檢驗外，還需重視其與制劑相容性引起的質量問題。