一測多評法測定石菖蒲中β-細辛醚、α-細辛醚的含量

趙俊赫 霍志鵬 連玉姣 邱守昊 王 玉 張依倩▲

1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.天士力醫藥集團股份有限公司研究院 現代中藥創制全國重點實驗室，天津 300410

石菖蒲為天南星科石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott）的干燥根莖，性辛、苦、溫，歸心、胃經[1]，具有開竅豁痰、醒神益智、化濕開胃的功效，為開竅醒腦要藥[2-4]。石菖蒲中揮發性成分主要為β-細辛醚、α-細辛醚[5-7]，具有抗腫瘤、抗炎、抗癲癇、抗血栓、抗焦慮、抗癲癇、保護心腦血管等作用[8-13]。但石菖蒲藥材的主要活性成分β-細辛醚對照品價格昂貴，且對照品溶液不易配制。一測多評法（quantitative analysis of multi-components by singlemarke，QAMS）可以通過選擇一個成分為內標物，實現多個成分的定量分析，可減少成分定量分析的時間與成本，彌補對照品不足的問題，具有方便、易于操作等優點[14]。因此，本試驗嘗試以α-細辛醚為內標，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）計算α-細辛醚與β-細辛醚的相對矯正因子，建立QAMS測定石菖蒲中β-細辛醚、α-細辛醚的含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Waters e2695-2998型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司）；昆山舒美KQ-500DE超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；XS-205DU電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

石菖蒲藥材（批號：20190101，安徽省永香中藥飲片有限公司）；β-細辛醚（天士力控股集團有限公司研究院），α-細辛醚（批號：L1913066，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；色譜甲醇、色譜乙腈（德國默克公司）；無水乙醇（天津康科德科技有限公司）；超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色 譜 柱 為Agilent Eclipse XDB C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）。流動相：0.05%磷酸水（A）-乙 腈（B），梯 度 洗 脫：0～28 min，35%～42%B；28～31 min，42%～90% B；31～34 min，90%～35% B。流速：1 ml/min；柱溫30℃；進樣體積10 μl；檢測波長254 nm。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖（254 nm）

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 稱取石菖蒲藥材粉末（過4號篩）0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱重，超聲15 min，放冷，用甲醇補足失重，搖勻，過濾，取續濾液，過0.2 μm微孔濾膜，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 取對照品β-細辛醚、α-細辛醚適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為92.20、21.32 μg/ml混合對照品溶液。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性試驗 取空白溶劑（甲醇）、2.2項下制備的各溶液按2.1項下色譜條件分別進樣、測定，觀察各個待測物與對照品出峰時間是否一致。結果表明β-細辛醚、α-細辛醚兩成分與相鄰色譜峰均能達到分離，分離度均≥1.5，拖尾因子≤1.5，分離良好，且與對照品出峰時間一致。

2.3.2 精密度試驗 取2.2項下配置的混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件重復進樣6次，測定待測組分的峰面積，計算其RSD。β-細辛醚峰面積的RSD為1.04%，α-細辛醚峰面積的RSD分別為1.09%，結果表明儀器精密度良好。

2.3.3 線性關系考察 精密稱取β-細辛醚、α-細辛醚對照品適量，加甲醇配成濃度依次為461.00、106.62 μg/ml的混合對照品溶液，作為線標溶液a，依次用甲醇稀釋2、4、8、16、32倍，制成β-細辛醚230.50、115.25、57.63、28.81、14.41 μg/ml，α-細辛醚53.31、26.66、13.33、6.66、3.33 μg/ml的混合對照品溶液，作為線標溶液b～f。依次精密吸取線標溶液a～f各適量，按2.1項下色譜條件分別進樣，記錄峰面積，以質量濃度（X，μg/ml）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，并計算相關系數。β-細辛醚線性回歸方程為Y=30270.0X-4283.3，線 性范 圍14.41～461.00 μg/ml，α-細 辛 醚 的線性回歸方程為Y=44 614.8X-6967.2，線性范圍3.33～106.62 μg/ml，R2均為0.9999，表明兩成分線性關系良好。

2.3.4 穩定性試驗 取混合對照品溶液與同一份供試品溶液，分別于溶液制配制后0、2、4、8、12、16、24 h，按2.1項下色譜條件進樣，測定待測組分的峰面積，計算對照品溶液與供試品溶液中β-細辛醚和α-細辛醚峰面積的RSD。對照品溶液中β-細辛醚和α-細辛醚峰面積的RSD均為1.05%，供試品溶液中β-細辛醚和α-細辛醚峰面積的RSD分別為0.61%和0.56%。結果表明對照品溶液與供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.5 重復性試驗 取同一批次的石菖蒲藥材粉末適量，按2.2項下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄待測組分的峰面積，分別計算各成分含量。β-細辛醚和α-細辛醚含量平均值分別為20.1655 mg/g和5.5680 mg/g，RSD分別為0.94%和0.97%（n=6），結果表明方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率 取已知含量的石菖蒲藥材粉末適量，研細，取6份，每份約0.1 g，精密稱定，分別加入精密稱定的β-細辛醚對照品2.0440 mg，α-細辛醚對照品0.5468 mg，按2.2項下供試品溶液制備方法平行制備加標溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，計算β-細辛醚和α-細辛醚的加樣回收率及RSD值。β-細辛醚和α-細辛醚的平均加樣回收率分別為98.69%和100.24%，RSD分別為2.04%和2.06%。

2.4 待測組分色譜峰的定位

采用相對保留時間（t）對色譜峰進行定位，即t待測組分/內標=t待測組分/t內標，計算不同儀器和不同色譜柱條件下β-細辛醚與α-細辛醚的相對保留時間平均值為0.8723，RSD為0.31%，結果見表1，結果表明不同品牌儀器及色譜柱檢測所得目標峰的相對保留時間沒有明顯的差異。

表1 兩種成分的相對保留時間

2.5 相對校正因子的測定和計算

取2.3.3項下混合對照品溶液a～f各適量，按2.1項下色譜條件依次進樣，記錄兩種成分的峰面積，以α-細辛醚為內標，按照相對校正因子計算公式fis=fi/fs=（mi×As）/（ms×Ai）計算α-細辛醚對β-細辛醚的校正因子，其中i為某化合物，s為內標物，m為質量，A為峰面積。計算所得相對校正因子平均值為1.4572，RSD為1.26%，結果見表2。

表2 相對校正因子

2.6 相對校正因子重現性考察

2.6.1 不同儀器和色譜柱對相對校正因子值的影響 考察了2種品牌高效液相色譜儀（Waters e2695、Agilent 1200）和3種不同品牌色譜柱[Agilent Eclipse XDB C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）、Alltima C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）、Kromasil C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）]對相對校正因子的影響，結果見表3，RSD為0.64%，表明在不同液相色譜系統下所得的相對校正因子基本一致。

表3 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響

2.6.2 不同柱溫、流速、進樣體積對相對校正因子值的影響 分別考察了不同柱溫（25℃、30℃、35℃）、不同流速（0.9、1.0、1.1 ml/min）、不同進樣體積（8、10、12 μl）對相對校正因子的影響，結果表明在不同柱溫、流速、進樣體積下所得的相對校正因子基本一致。

2.7 QAMS與外標法（external standard method，ESM）結果比較

分別取14批石菖蒲藥材粉末（過4號篩），每批3份，按2.2項下平行制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件依次進樣測定，記錄兩種成分的峰面積，分別采用ESM和QAMS計算所測各目標成分含量，結果見表4，可知兩種方法計算各成分的含量無明顯差異。

表4 QAMS與ESM結果比較（n=3）

3 討論

3.1 檢測波長的考察

本試驗對β-細辛醚、α-細辛醚進行全波長掃描，最大吸收波長分別為252、258 nm，參考文獻[15-16]并兼顧兩種成分的紫外吸收情況，選擇254 nm作為檢測波長。結果表明在254 nm波長下，基線較為平穩，β-細辛醚、α-細辛醚成分響應值較高，干擾峰較少。

3.2 樣品制備方法的選擇

分別考察了不同流動相（水-乙腈、0.05%磷酸水-乙腈、0.1%甲酸水-乙腈）、提取溶劑（無水乙醇、甲醇）與提取方式（超聲15、30、60 min）對兩種待測成分的影響，最終選定以0.05%磷酸水-乙腈溶液為流動相、甲醇超聲提取15min為最優方法。

3.3 內參物的選擇

石菖蒲揮發性成分中β-細辛醚含量高于α-細辛醚，但由于β-細辛醚對照品極易揮發，且價格昂貴，考慮到α-細辛醚對照品價格較低，化學性質較β-細辛醚更穩定，故本試驗選定α-細辛醚作為內參物來計算β-細辛醚的相對校正因子。

4 小結

課題組前期建立了一個可以同時定量β-細辛醚、α-細辛醚的HPLC含測方法。本研究石菖蒲藥材種含量較高且性質穩定的α-細辛醚為內標物，建立了α-細辛醚與β-細辛醚的相對校正因子，對石菖蒲藥材中的β-細辛醚、α-細辛醚進行含量測定，方法學結果均符合《中華人民共和國藥典》要求，在不同品牌儀器、流速、柱溫等條件下進樣分析發現該方法具有較高的重現性。通過對多批次石菖蒲藥材中兩成分含量測定，比較QAMS計算的含量值與ESM所測的含量值，結果表明無顯著差異。說明建立的α-細辛醚與β-細辛醚之間的校正因子具有較高的可信度。一定程度上解決了石菖蒲揮發性成分含測時β-細辛醚對照品價格昂貴且不易配制的問題，為石菖蒲的質量控制提供了有效的方法。