HPLC法測定溴芬酸鈉滴眼液中聚合物的含量

吳永芹 薛 雯 孟 龍 王 軍 韓 勇 張 瑩

1.山東省濟寧市食品藥品檢驗檢測研究院，山東濟寧 272073；2.山東省食品藥品審評查驗中心，山東濟南 250014

溴芬酸鈉,即[2-氨基-3-（4-溴苯甲酰基）苯基]乙酸鈉，其制劑0.1%溴芬酸鈉滴眼液于2000年在日本上市，于2015年在國內(nèi)批準生產(chǎn)上市。0.1%溴芬酸鈉滴眼液臨床應用較廣，主要用于外眼部及前眼部的炎癥的治療，如眼部手術后的炎癥、結(jié)膜炎等癥狀，其作用強度是其他非甾體抗炎藥的十倍，臨床效果顯著[1-6]。配方中的增稠劑聚維酮K30在儲存過程中與溴芬酸鈉發(fā)生聚合反應，生成聚合物雜質(zhì)U-Ⅱ，會降低主藥含量，同時使藥液黏性下降，療效降低，聚合物雜質(zhì)U-Ⅱ的產(chǎn)生同時增加了使用過程中的不良反應發(fā)生風險。本研究建立HPLC對溴芬酸鈉滴眼液中產(chǎn)生的聚合物的含量進行測定，為控制其藥品質(zhì)量提供方法依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-2030C型高效液相色譜儀（DAD檢測器）（日本島津）；流動相吸附柱（4.6 mm×50 mm）（中譜科技），色譜柱：Waters C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；TE214S型電子天平、BS21S型電子天平[賽多利斯科學院儀器（北京）有限公司]；FE28酸度計（梅特勒-托利多儀器有限公司）、磷酸氫二鉀（天津市光復精細化工研究所，優(yōu)級純）；乙腈（天津四友，HPLC級）；磷酸（阿拉丁，HPLC級）；超純水（實驗室自制，電阻率18.2 MΩ）；溴芬酸鈉對照品（LGC，W1008660）；聚維酮對照品（中檢院，批號：190070-201501），溴 芬 酸 鈉 滴 眼 液[批 號：0A0021M10、0A0011M10（A廠 家），1907033101、1907053101、1912073102、2001013101、2001033101、2006043101、2007063101、2007083101（B廠家），P432（C廠家）]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動相A為0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液（pH 4.5）-乙腈（75∶25），流動相B為乙腈；梯度洗脫：0～5 min（0%B），5～10 min（0%→28%B），10～30 min（28%B），30～30.1 min（28%→0%B），30.1～60 min（0%B）；柱溫30℃，流速1.0 ml/min，檢測波長400 nm，進樣量20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取溴芬酸鈉對照品10.01 mg，置100 ml棕色量瓶中，加入30 ml流動相A，振搖使對照品溶解，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液①，精密量取1 ml，置100 ml棕色量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取溴芬酸鈉滴眼液2 ml，置10 ml棕色量瓶中，加入流動相A振搖并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 聚維酮K30陰性對照溶液的制備 制備不含聚維酮K30的陰性供試品，精密量取2 ml，置10 ml棕色量瓶中，加流動相A振搖并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 聚維酮K30對照溶液的制備 取聚維酮K30原料，加流動相A制成濃度為2 mg/ml的溶液。精密量取2 ml，置10 ml棕色量瓶中，加流動相A振搖并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 專屬性試驗考察

精密吸取上述溶液各20 μl進樣測定，見圖1，結(jié)果表明，聚合物峰與相鄰色譜峰分離良好，出峰時間約為10 min，陰性對照無干擾，在400 nm波長處聚維酮K30無吸收，對聚合物的測定無干擾。

圖1 專屬性試驗色譜圖

2.4 線性關系考察

分別精密量取2.2.1下不同體積的對照品溶液①，置50 ml棕色量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，制備得到濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/ml的系列標準溶液，精密吸取20 μl，進樣測定，以濃度C（μg/ml）為橫坐標，峰面積A（μv·ms）為縱坐標作圖，得到其回歸方程為A=11463.95C-130.90，r=0.9995，結(jié) 果 表 明 在 進 樣 量 為20 μl時，在0.1～10.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)，線性關系良好。見圖2。

圖2 線性關系曲線圖

2.5 精密度試驗

精密量取對照品溶液（濃度為1 μg/ml），進樣6次，峰面積（μv·ms）分別為14 484、14 433、14 459、14 535、14 499、14 382，RSD為0.38%。取 供試品溶液，重復進樣6次，峰面積（μv·ms）分別為14 753、14 684、14 293、14 574、14 154、14 982，RSD為2.1%。試驗結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

考察溶液24 h穩(wěn)定性，峰面積（μv·ms）分別為18 468（0 h）、17 463（2 h）、18 132（4 h）、18 088（8 h）、16 268（12 h）、12 543（24 h），結(jié)果樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定，8 h內(nèi)RSD為2.9%。

2.7 重復性試驗

取溴芬酸鈉滴眼液，按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，共6份，進樣測定，峰面積（μv·ms）分別為13 489、13 198、13 734、13 216、13 324、13 148，以峰面積計算，RSD為1.7%，試驗結(jié)果表明，樣品的重復性試驗良好。

2.8 檢出限和定量限

取溴芬酸鈉對照品溶液，逐步稀釋，按照信噪比S/N=3確定檢出限溶液的濃度，檢出限溶液濃度為0.02 μg/ml，按照信噪比S/N=10確定定量限溶液的濃度，定量限溶液濃度為0.05 μg/ml。將供試品溶液稀釋5倍，精密吸取20 μl，進樣測定，色譜圖中聚合物峰的信噪比S/N=10，計算聚合物含量，定量限濃度相當于溴芬酸鈉標示量的0.03%。

2.9 測定結(jié)果

按照建立的測定方法，測定三個廠家的11批樣品，聚合物含量按照溴芬酸鈉標示量計算，結(jié)果范圍為0.1%～1.5%，分別按照各自現(xiàn)行法定標準進行測定，結(jié)果范圍為0.1%～3.2%，聚合物測定結(jié)果見表1。

表1 聚合物測定結(jié)果（n=3）

3 討論

本研究考察了不同pH值的0.1%三乙胺-乙腈體系、不同pH值的0.0025 mol/L庚烷磺酸鈉-乙腈體系、不同pH值的0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液-乙腈體系；考察了C8色譜柱、C18色譜柱、凝膠色譜柱G-10、TSKgel SuperMultiporePW-M尺寸排阻色譜柱；考察了蒸發(fā)光散射檢測器、紫外檢測器、示差折光檢測器。當采用C18色譜柱，紫外檢測器，以0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液-乙腈體系為流動相時，聚合物與其他組分分離效果最好，可以進行準確定量。由于聚維酮K30為大分子物質(zhì)，在C18色譜柱上出峰峰型較寬，且在色譜柱有殘留，需提前進行色譜柱的飽和[7-17]。

聚合物是溴芬酸鈉與聚維酮K30在藥品的儲存期間聚合產(chǎn)生的，無法分離純化得到聚合物雜質(zhì)純品，市面上無聚合物雜質(zhì)對照品出售，無法用對照品進行定量。現(xiàn)行國內(nèi)外標準中聚合物的計算方式，采用樣品峰面積直接扣除空白溶液中聚維酮K30峰面積，取峰面積差值，按外標法進行計算。聚維酮K30對照品的稱樣量或者峰面積值大小直接影響計算結(jié)果，甚至會出現(xiàn)負值，測定結(jié)果與聚維酮K30投料的多少和聚維酮K30對照品取樣量的多少直接相關，存在監(jiān)控風險。經(jīng)比較分析溴芬酸鈉對照品和聚維酮K30原料的紫外吸收光譜圖，溴芬酸鈉在400 nm波長處有較大的吸收，而聚維酮K30在400 nm波長處無紫外線吸收，不影響聚合物的定量，故檢測波長選擇為400 nm。

現(xiàn)行標準方法的供試品色譜圖中聚合物峰型極不規(guī)則，基線不平，且計算方式不合理，含量測定的結(jié)果不準確，測定結(jié)果值差異較大。本研究選擇在無干擾的400 nm波長處采集信號，以外標法直接計算含量，與現(xiàn)行標準方法比較，結(jié)果更準確可靠。但由于各個批次供試品聚合物的形成具有不確定性，結(jié)果差異也較大。

本研究建立了溴芬酸鈉滴眼液中聚合物的含量測定方法，方法簡便、快速，可用于控制溴芬酸鈉滴眼液聚合物的含量，也為其質(zhì)量控制方法的研究提供了參考。