基于單細胞RNA測序及生物信息學分析AFAP1L1在胃癌中的臨床意義

柯帥屹 王鴻泰 沈凱譽 劉俊杰 呂建輝 高文倉

1.浙江省仙居縣人民醫院內科，浙江仙居 317399；2.浙江省仙居縣人民醫院普外科，浙江仙居 317399；3.浙江中醫藥大學第二臨床醫學院，浙江杭州 310053；4.浙江中醫藥大學嘉興學院聯合培養，浙江嘉興 314001；5.浙江中醫藥大學附屬第二醫院腫瘤科，浙江杭州 310005

胃癌（gastric cancer，GC）是世界上第四大常見 癌癥，也是癌癥病死的第二大原因[1]，其發病機制復雜[2]。GC確診時多為中晚期，常規治療手段無法改善低生存率[3]。化療作為晚期GC的主要治療手段，以氟尿嘧啶類藥物為基礎，聯合鉑類和卡培他濱類組成兩藥或三藥為一線治療[4-5]，但患者中位總生存期仍然較短。生物標志物對GC的診斷和治療具有重要的指導作用[6-8]。

肌動蛋白絲相關蛋白（actin filament associated protein，AFAP）家族的成員包括AFAP1、AFAP1相似 蛋 白1（actin filament-associated protein 1 like 1，AFAP1L1）和AFAP1相似蛋白2（actin filamentassociated protein 1 like 2，AFAP1L2）。通過形成蛋白質-蛋白質/脂質復合物參與調控腫瘤進展，AFAP家族成員作為腫瘤預后相關標志物成為可能[9]。其中，AFAP1L1已被發現在多種腫瘤中具有促癌作用[9-11]。然而在GC中的預后價值仍不清楚。本研究基于癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數據庫和基因表達綜合（gene expression omnibus，GEO）數據庫中的傳統測序和單細胞RNA測序（single-cell RNA sequence，scRNA-seq）數據探索了AFAP1L1在GC中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 數據獲取

從TCGA數據庫下載GC轉錄組、臨床數據。從GEO數據庫的GSE27342、GSE54129、GSE65801、GSE79973和GSE167297獲取轉錄組和scRNA-seq數據。

1.2 方法

1.2.1 AFAP1L1表達分析 在TCGA和GEO隊列中檢測了AFAP1L1在GC和正常胃組織中的差異表達水平和診斷價值，并探索AFAP1L1和各臨床特征之間的關系。

1.2.2 AFAP1L1的預后意義 GEPIA數據庫和單、多因素Cox分析AFAP1L1對GC生存預后的影響。

1.2.3 AFAP1L1相關信號通路富集分析 按照AFAP1L1的表達中位值將GC樣本分為高、低AFAP1L1兩組，并以|log2（fold-change）≥1|和錯誤發現率＜0.05為標準篩選差異基因并進行富集分析。

1.2.4 藥物敏感性預測 基于癌癥藥物敏感性基因組學研究數據庫探索AFAP1L1表達與不同抗腫瘤藥物反應之間的關系。

1.2.5 scRNA-seq分析 使用“Seurat”包創建了分析對象，＜10個細胞中表達的基因和表達＞200個基因的細胞。線粒體基因比例＜15%的細胞樣本用于后續分析。主成分分析，非線性降維聚類用于識別細胞標記基因。“SingleR”包用于細胞簇的注釋。

1.3 統計學方法

使用R 4.1.0軟件進行數據處理。采用Kruskal-Wallis檢驗來評估臨床病理參數與AFAP1L1表達水平之間的關系。采用Kaplan-Meier方法、數秩檢驗和Cox回歸分析進行生存分析。兩組之間比較采用秩和檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AFAP1L1在GC組織中過表達

對TCGA隊列的分析表明，AFAP1L1在GC組織中表達程度顯著高于正常胃組織樣本，差異有統計學意義（P＜ 0.05）（圖1a）。這與GEO數據集結果一致（圖1b）。受試者工作特征曲線表明AFAP1L1具有良好診斷價值（圖1c）。此外，AFAP1L1上調與不良臨床表型（分級、分期及腫瘤浸潤深度）相關（圖2）。

圖1 AFAP1L1在GC中的表達

圖2 AFAP1L1與不同臨床特征的關系

2.2 AFAP1L1的表達與GC患者預后的關系

生存分析顯示AFAP1L1基因的低表達提示預后良好（P＜ 0.05）（圖3a）。單、多Cox回歸分析顯示，高AFAP1L1表達預示高風險[HR=1.539（1.143～2.072），P=0.004]（圖3b），且AFAP1L1是 獨 立 危 險 因 素[HR=1.387（1.022～1.881），P=0.035]（圖3c）。AFAP1L1-列線圖顯示了良好預測效能（圖3d～e）。

圖3 AFAP1L1的預測價值

2.3 基因富集分析預測AFAP1L1的功能

在高、低AFAP1L1表達GC患者中（圖4），富集分析結果提示AFAP1L1相關差異表達基因參與血管生成的調控、上皮細胞增殖活性，與磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路、焦點粘連等通路相關（圖5a～b）。

圖4 高、低AFAP1L1組中的差異基因

圖5 功能富集分析

2.4 AFAP1L1與藥物敏感性的關系

本研究探討AFAP1L1與部分抗腫瘤藥物半最大抑制濃度的關系。AFAP1L1高表達分組對達沙替尼、福瑞替尼和帕唑帕尼的敏感性較高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。而對吉西他濱、甲氨蝶呤和替吡法尼的敏感性較差，差異有統計學意義（P＜ 0.05）（圖6）。

圖6 高、低AFAP1L1組中與不同抗腫瘤藥物敏感性的關系

2.5 單細胞RNA測序數據的分析

在GC和癌旁組織的scRNA-seq數據中，篩選得到19 766個高質量細胞，這些細胞被聚類為19個亞群（圖7a）。本研究對細胞的來源進行可視化（圖7b），并最終將它們注釋為B細胞、T細胞、巨噬細胞、間充質細胞、上皮細胞、內皮細胞和漿細胞（圖7c）。AFAP1L1主要表達于GC組織來源的細胞，而癌旁胃組織中無明顯表達（圖7d），且AFAP1L1主要表達于內皮細胞（圖7e）。

圖7 AFAP1L1在單細胞水平的表達

3 討論

AFAP家族成員與腫瘤的進展密切相關。AFAP1具有肌動蛋白絲銜接蛋白的功能，參與癌癥細胞生長、侵襲等過程[11-12]。AFAP110發揮銜接肌動蛋白絲作用[13]。其控制蛋白激酶Ca介導的原癌基因C的激活[14]。AFAP1L2上調參與GC的曲妥珠單抗耐藥[15]。AFAP1L1的異常表達促進梭形細胞肉瘤和結腸癌的不良預后[10，16]，但在GC中的表達情況仍不清楚。

本研究發現AFAP1L1在GC組織中顯著過表達，且與不良臨床特征和低生存率相關。本研究構建的AFAP1L1-列線圖顯示了良好的預測效能。此外AFAP1L1高表達GC患者對達沙替尼、福瑞替尼和帕唑帕尼等藥物敏感性較強。這可能為GC的精準治療提供新的策略。

scRNA-seq數據驗證了AFAP1L1在GC組織中的表達，進一步分析發現AFAP1L1主要表達于GC相關血管內皮細胞，這驗證了先前富集分析中AFAP1L1可能參與血管生成調控的結果。

綜上所述，AFAP1L1在GC中表達升高且與不良預后相關，有望成為GC潛在的診斷和治療靶點。然而，本研究基于公共數據庫對AFAP1L1展開分析，因此存在一定的局限性，其生物學機制有待未來在臨床與基礎實驗中得到證明，此外，AFAP1L1在蛋白組層面的功能有待進一步探索。