β-紫羅蘭酮通過Caspase-3信號通路對乳腺癌細胞生物學行為的調控作用

王桂園 田冬雪 李 南

作者單位：473000 河南省南陽市中心醫院

β-紫羅蘭酮廣泛存在于各種蔬菜水果以及牛奶中,是一種生物活性很強的物質,能誘導多種類型的惡性腫瘤細胞凋亡,在抑癌領域中受到廣泛的關注[1-3]。有學者應用動物實驗發現,β-紫羅蘭酮能有效抑制大鼠乳腺癌模型的形成,但關于β-紫羅蘭酮在抑制乳腺癌形成的具體作用機制尚不清楚[4-6]。但腫瘤的發生及發展與細胞異常增殖及凋亡密切相關,腫瘤細胞常無限增殖,且凋亡被抑制,進而促進腫瘤的發生。探究β-紫羅蘭酮在調節人乳腺癌MCF-7細胞生物行為中的作用,有助于了解β-紫羅蘭酮在抑制乳腺癌中的作用機制,基于以上背景,本文開展如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人乳腺癌細胞MCF-7購自中國科學院研究所。將MCF-7細胞接種于含12%胎牛血清與青鏈霉素的DMEM培養基,置于細胞培養箱內,于37 ℃,5% CO2環境中培養,使用EDTA/胰酶混合液消化傳代,取對數生長期細胞進行實驗。

1.1.2 受試物 β-紫羅蘭酮購自Sigma公司(純度≥95%),根據細胞毒性實驗,確定β-紫羅蘭酮劑量分別為5 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組及200 μmol/L。

1.1.3 主要試劑 Trizol、Easy-LoadTMPCR Master Mix、BeyoRTTMcDNA第一鏈合成試劑盒、Hoechst 33258染色液、CCK-8檢測試劑盒均購自上海碧云天。兔抗Capase-3及β-actin一抗、羊抗兔IgG(H+L)HRP標記二抗均購自美國Affinity Biosciences公司,引物均由南京金斯瑞生物科技合成。

1.1.4 試驗儀器 包括ZFM-700型倒置熒光顯微鏡、Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳系統、T100型PCR儀及ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法檢測細胞增殖率 對數生長期MCF-7細胞按照5×104/mL密度接種于96孔培養板,培養24 h后,空白對照組加入完全培養液100 mL,實驗組分別加入不同濃度β-紫羅蘭酮,每組設5個復孔,72 h后,向每孔內加入10 μL CCK-8溶液,繼續孵育4 h,置于酶標儀450 nm波長下測定OD值,計算細胞增殖抑制率。

1.2.2 臺盼藍計數法檢測細胞生長曲線 MCF-7細胞按照3×103密度接種于96孔培養板,培養24 h后更換為不同濃度β-紫羅蘭酮,培養1～7 d,每天培養結束前4 h加入MTT 50 μL,培養結束后每孔中加入200 μL DMSO,酶標儀檢測A值,計算細胞生長增殖抑制率與IC50。

1.2.3 Hoechst 33258熒光染色法檢測細胞凋亡情況對數期生長MCF-7細胞以2×104/mL密度接種于12孔板,培養24 h,空白對照組及實驗組處理方式同上,孵育72 h后使用4%多聚甲醛于4 ℃下固定30 min,PBS漂洗,加入Hoechst 33258染色液,熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡狀況。

1.2.4 RT-PCR檢測Caspase-3 mRNA表達情況 對數生長期MCF-7細胞以2×105/mL密度接種于6孔板內,培養24 h,2組處理方式同上,孵育72 h。Trizol提取細胞RNA,逆轉錄為cDNA,然后加入Easy-LoadTM PCR Master Mix等進行PCR擴增實驗,反應條件:95 ℃預變性5 min,95 ℃ 35 s,58 ℃ 35 s,70 ℃ 30 s,30個循環,70 ℃延伸15 min。Caspase上游引物:5'-CAGCTCATACCTGTGGCTGT-3',下游引物:5'-TTCCCTGAGGTTTGCTGCAT-3'。β-actin上游引物:5'-CTTCGCGGGCGACGAT-3',下游引物:5'-CCACATAGGAATCCTTCTGACC-3'。擴增產物加入瓊脂糖凝膠加樣孔中進行水平電泳,紫外透視下觀察結果,置于凝膠成像系統內拍照,以β-actin為參照,分析Caspase-3 mRNA相對表達量。

1.2.5 Western Blot法檢測Caspase-3蛋白表達水平細胞培養分組及給藥同上,孵育72 h,按照Western Blot實驗步驟進行蛋白提取,電泳,轉膜,封閉,一抗、二抗孵育,最后進行凝膠成像,比較Caspase-3與β-tubulin蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 β-紫羅蘭酮對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響

與空白對照組相比,經不同濃度β-紫羅蘭酮處理后的乳腺癌MCF-7細胞OD值均顯著下降(P<0.05),實驗組中經β-紫羅蘭酮濃度分別為25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L及200 μmol/L處理后的MCF-7細胞增殖抑制率分別為7.92%、28.96%、45.22%和56.83%。見表1。

表1 β-紫羅蘭酮對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響

2.2 β-紫羅蘭酮對人乳腺癌MCF-7細胞生長的影響

不同濃度β-紫羅蘭酮處理過的MCF-7細胞從第2天開始,較空白對照組的細胞計數顯著降低(P<0.05),空白對照組及β-紫羅蘭酮濃度25 μmol/L組MCF-7細胞計數在7 d內隨時間遷移呈上升趨勢,經β-紫羅蘭酮濃度50、100及200 μmol/L處理后的MCF-7細胞7 d內細胞計數呈下降趨勢。見表2、圖1。

圖1 β-紫羅蘭酮對人乳腺癌MCF-7細胞生長的影響

表2 β-紫羅蘭酮對人乳腺癌MCF-7細胞生長的影響

2.3 β-紫羅蘭酮對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡形態學的影響

與空白對照組相比,給予 β-紫羅蘭酮處理過的人乳腺癌MCF-7細胞,Hoechst 33258熒光染色可見致密顆粒強熒光聚集,不同程度細胞核濃染、固縮及破裂等凋亡現象,200 μmol/L濃度的β-紫羅蘭酮組細胞出現以上現象最明顯。

2.4 β-紫羅蘭酮對人乳腺癌MCF-7細胞Caspase-3 mRNA表達的影響

與空白對照組相比,經不同濃度β-紫羅蘭酮處理過的MCF-7細胞Caspase-3 mRNA表達水平均顯著上升(P<0.05),且隨β-紫羅蘭酮濃度的升高,其Caspase-3 mRNA表達呈上升趨勢(P<0.05)。見表3。

表3 β-紫羅蘭酮對人乳腺癌MCF-7細胞Caspase-3 mRNA表達的影響

2.5 β-紫羅蘭酮對人乳腺癌MCF-7細胞Caspase-3蛋白表達的影響

β-紫羅蘭酮對人乳腺癌MCF-7細胞Caspase-3蛋白表達的影響與Caspase-3 mRNA相同。見圖2。

3 討論

乳腺癌一直是女性發病率最高的惡性腫瘤,也是造成女性病死的主要原因。積極尋找預防及治療乳腺癌的有效措施,是提高女性生命質量的重要前提。與其他惡性腫瘤一樣,乳腺癌的發生及發展涉及到細胞增殖及凋亡異常。細胞凋亡原本是一種細胞自主性死亡的形式,是機體清除衰老及異常細胞,維持內態穩定的基礎之一。但當基因突變發生,細胞增殖及凋亡失衡,增殖占優勢而凋亡被抑制,將誘導并促進惡性腫瘤的發生[7-10]。

β-紫羅蘭酮是一種存在于瓜果蔬菜中的多酚類單體,具有異戊二烯單體成分,該成分具有很強的生物活性,在抑癌方面的功效得到了臨床廣泛的關注。張華磊等[11]對β-紫羅蘭酮改造結果及其衍生物抗癌活性進行研究發現,β-紫羅蘭酮結構中的三甲基環乙烯基、丁烯酮側鏈結構改造及活動亞結構所拼接所得到的β-紫羅蘭酮衍生物,在前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌等多種惡性腫瘤中均具有一定的抑制作用,提示β-紫羅蘭酮的抗癌功效,但目前,關于β-紫羅蘭酮在抑癌方面的作用僅限制于細胞層面的研究,并無臨床研究數據。

本研究將人乳腺癌MCF-7細胞作為研究材料,分別利用不同濃度的β-紫羅蘭酮進行處理,檢測細胞經β-紫羅蘭酮處理后的增殖、生長及凋亡情況,結果顯示,經β-紫羅蘭酮處理過的MCF-7細胞細胞增殖情況被抑制,且隨著β-紫羅蘭酮濃度的上升,細胞增殖抑制率越高,且細胞凋亡表現越嚴重。繪制各分組MCF-7細胞生長曲線發現,空白對照組以及β-紫羅蘭酮濃度為25 μmol/L的MCF-7細胞7 d內生長曲線呈上升趨勢,但β-紫羅蘭酮干預的細胞生長曲線在空白對照組之下,經β-紫羅蘭酮濃度為50 μmol/L、100 μmol/L及200 μmol/L的分組細胞,7 d內生長曲線呈下降趨勢。以上研究結果表明,β-紫羅蘭酮干預能有效抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖與生長,促進細胞凋亡,且這種抑制生長促進凋亡的作用與β-紫羅蘭酮濃度呈劑量型相關。

關于β-紫羅蘭酮在抑制腫瘤細胞生長,促進細胞凋亡中的報道較多,但關于β-紫羅蘭酮具體通過哪種信號通路實現的抑癌作用尚不清楚。已知細胞凋亡主要涉及到三條通路,而這三條通路最終都關乎到Caspase的激活,Caspase-3是哺乳動物細胞凋亡的關鍵蛋白酶[12-13]。有研究報道[14-15]乳腺癌、胰腺癌組織樣本中Caspase-3表達水平明顯升高,Caspase-3表達與細胞凋亡及組織學侵襲性呈平行相關。本研究分別應用RT-PCR及Western Blot法檢測β-紫羅蘭酮處理后MFC-7細胞內Caspase-3 mRNA及蛋白表達情況發現,經不同濃度β-紫羅蘭酮處理后的MCF-7細胞內Caspase-3 mRNA及蛋白表達均較對照組明顯增強,證實β-紫羅蘭酮能促進癌細胞凋亡。推測β-紫羅蘭酮通過激活Caspase-3信號通路,抑制乳腺癌細胞增殖與生長,促進其凋亡,發揮抑癌作用。

綜上所述,β-紫羅蘭酮可能通過激活Caspase-3信號通路,抑制乳腺癌細胞增殖與生長,促進其凋亡,發揮抑癌作用。