LncRNA-HAGLROS調控miR-26b/JAK2/STAT3通路對肝癌細胞上皮間質轉化的影響

李肖蕓 方家遠 閆春雷 宋華勇

肝癌是肝硬化、慢性肝病等患者中常見的死亡誘因[1-2]。目前肝癌患者的死亡率仍在繼續增長[3]。目前認為,肝癌誘發的危險因素主要與以下因素存在關系,如飲酒、超重、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒的慢性感染、吸煙等[4]。臨床上常采用手術切除術、肝移植方式進行治療,但總體療效欠佳,大部分患者術后存在復發或轉移,嚴重影響術后恢復[5]。因此,對于肝癌患者的治療,積極尋找有效治療方案尤為重要。HAGLROS可參與多種腫瘤疾病的發生和發展,如結直腸癌[6]、胃癌[7]、肺癌[8]及骨肉瘤[9]等。如吳鵬的研究中[10],HAGLROS在胃癌患者中的表達明顯上升,且患者預后較差,HAGLROS可以促進胃癌疾病進展,如增殖和侵襲等。又有研究稱[11],HAGLROS可參與直腸癌細胞凋亡、自噬等過程。還有研究發現[12],HAGLROS在肝癌患者中的表達也出現明顯異常。因此,關于HAGLROS的分子機制有待進一步研究。miR-26b為常見抑瘤基因,在多種腫瘤疾病中表達均異常。最近研究稱[13],miR-26b可與部分LncRNAs競爭性結合,參與腫瘤發展。本次研究主要基于細胞實驗探尋HAGLROS和miR-26b在肝癌中的作用,現將內容報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

細胞:正常肝細胞系LO2及肝癌細胞系(Hep3B、MHCC-LM3、Huh7、SMMC-7721)。試劑:脂質體轉染試劑Lipofectamine 3000,RPMI 1640培養基,實時熒光定量PCR試劑盒、逆轉錄試劑盒,MTT增殖檢測試劑盒,E-Cadherin、N-cadherin、FN、Bcl-2、p-JAK2、p-STAT3一抗抗體,HRP標記的二抗抗體,miR-126b抑制劑(inhibitor)、HAGLROS干擾序列,qPCR引物,pmirGLO reporter檢測試劑盒,熒光檢測試劑盒等。

1.2 細胞培養

細胞復蘇,接種于培養基,加10%胎牛血清、1%雙抗,置于恒溫培養箱內進行培養,環境條件為37 ℃、5% CO2,依據細胞生長情況換液處理。分別將si-NC、si-HAGLROS、miR-26b inhibitor與Lipofectamine 3000混合處理,室溫環境下培養,15 min后進行細胞轉染操作,觀察細胞生長情況,待進入至對數生長期后,予以適量0.25%胰蛋白酶溶液傳代,預轉染細胞生長至50%,更換無血清培養基。分組,即si-NC組、si-HAGLROS組、miR-26 inhibitor組、si-HAGLROS+miR-26 inhibitor組。

1.3 MTT實驗

獲取對數期細胞,每孔1×104個接種至96孔板,生長至80%,轉染,每組設3個重復,于轉染0 h、24 h、48 h、72 h后予以5 μg/μl MTT,孵育,4 h后,終止反應。酶標儀檢測吸光度。再以空白孔作為對照,檢測各組細胞增殖活性。

1.4 細胞劃痕實驗

依據5×105個/ml接種至6孔板,采用無菌槍頭劃痕,倒置顯微鏡拍照,細胞置于無血清培養基培養,再將其置于恒溫培養箱內培養,環境條件為37 ℃、5% CO2,24 h后,采用倒置顯微鏡觀察細胞劃痕情況,并進一步計算劃痕率。

1.5 細胞侵襲實驗

取Transwell小室,水化包被好,重懸,密度1×105個/孔接種,下室予以10%胎牛血清培養,24 h后,取出小室,予以4%多聚甲醛溶液進行固定操作,30 min后,室溫環境下風干處理,予以適量結晶紫溶液染色,采用顯微鏡觀察。

1.6 qPCR法

轉染48 h后,TRIzol試劑提取總RNA,分析RNA質量,反轉錄操作,合成cDNA。反應條件如下,95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,40 cycles,60 ℃ 30 s。內參物均為GAPDH,miR-26b內參為U6,采用2-△△Ct計算。HAGLROS上游引物序列:5'-GGAAGGGCTCCTTACTTTC-3',HAGLROS下游引物序列:5'-GGAGGCTTTATCCCA-GTTC-3';E-Cadherin上游引物序列:5'-GGAACGCTCTC-GGTTATTC-3',E-Cadherin下游引物序列:5'-GGCTCTAACTATGTCGGTC-3',FN上游引物序列:5'-GAAGTCCGTTCGCTGATTC-3',FN下游引物序列:5'-GATTCTCCGATGCTAGGTC-3',Bcl-2上游引物序列:5'-GAATCCGTAGCGTCTGTTC-3',Bcl-2下游引物序列:5'-GACGTAGCCTCTTGTGATC-3',GAPDH上游引物序列:5'-GAACGTATGGTGCTCTCTC-3',GAPDH下游引物序列:5'-GACTCGCCGTGTGTAATTC-3',U6上游引物序列:5'-GAAGATTGCTGTTCTCCGC-3',U6下游引物序列:5'-GAACTCCTTGTGGATTCGC-3',miR-126b上游引物序列:5'-GATCCTAGATTCGCTGTGC-3',miR-126b下游引物序列:5'-GATGTTCATCAGCGCTTGC-3'。

1.7 免疫蛋白印跡實驗(Western blot,WB)

轉染48 h后提取各組細胞總蛋白應用BCA法測定蛋白濃度。各組分別取等量的樣本進行SDS-PAE凝膠電泳后,將蛋白轉至PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉,加入E-Cadherin(1∶200)、N-cadherin(1∶200)、FN(1∶100)、Bcl-2(1∶100)、p-JAK2(1∶100)、p-STAT3(1∶200)抗體,4 ℃過夜。應用TBST洗膜3次,每次10 min。接著加入二抗在室溫溫育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min,加ECL發光劑,X線片曝光、顯影、定影。

1.8 雙熒光素酶報告基因

miR-26b、HAGLROS序列片段擴增,構建熒光報告質粒pHAGLROS、突變質粒pMut-HAGLROS,將miR-26b mimics、miR-NC與野生或突變質粒轉染,24 h后,收集。雙熒光報告基因試劑盒檢測。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 不同細胞內HAGLROS、miR-26b表達的差異性

肝癌細胞系Hep3B、MHCC-LM3、Huh7、SMMC-7721中HAGLROS表達均顯著高于LO2細胞,差異均具有統計學意義(P<0.05),而肝癌細胞系Hep3B、MHCC-LM3、Huh7、SMMC-7721中miR-26b表達均顯著低于LO2細胞,差異均具有統計學意義(P<0.05)。由于SMMC-7721細胞中HAGLROS表達最高,因此,后續研究均采用SMMC-7721細胞進行實驗。見表1。

表1 不同細胞內HAGLROS、miR-26b表達的差異性

2.2 HAGLROS、miR-26b轉染效率

與未轉染的SMMC-7721細胞、轉染si-NC SMMC-7721細胞比較,分別轉染干擾序列HAGLROS-1、si-HAGLROS-2后,SMMC-7721細胞中HAGLROS表達均出現明顯下降趨勢,差異具有統計學意義(P<0.05),其中si-HAGLROS-1感染后下降率更低,因此,后續實驗選取si-HAGLROS-1序列干擾SMMC-7721細胞。見表2。與未轉染的SMMC-7721細胞、轉染si-NC SMMC-7721細胞比較,轉染干擾序列 inhibitor后,SMMC-7721細胞內miR-26b水平明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。見表3。說明轉染實驗成功。

表2 HAGLROS轉染效率

表3 miR-26b轉染效率

2.3 HAGLROS與miR-26b的靶向關系

采用生物信息學軟件顯示,HAGLROS與miR-26b存在互補核苷酸序列,見圖1。熒光酶報告基因實驗表示,與miR-NC組比較,miR-26b-5p mimics組活性更低,P<0.05;轉染突變型HAGLROS,miR-NC組與miR-26b-5p mimics組熒光素酶活性比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。與對照組、si-NC組進行比較,si-HAGLROS組miR-26b水平均顯著更高,差異具有統計學意義(P<0.05),見表5。

圖1 靶向結合核苷酸序列

表4 相對熒光強度

表5 miR-26b相對表達量

2.4 SMMC-7721細胞增殖變化

細胞轉染0 h、24 h后,si-NC組、si-HAGLROS組、miR-26b inhibitor組、si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組比較,差異均無統計學意義(P>0.05);轉染48 h、72 h后,與si-NC組比較,si-HAGLROS組細胞增殖活性下降,miR-26b inhibitor組與之相反,si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組與si-HAGLROS組比較,P<0.05。si-NC組與si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組細胞增殖活性比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 SMMC-7721細胞增殖變化

2.5 SMMC-7721細胞遷移變化

與si-NC組比較,si-HAGLROS組細胞劃痕愈合率更低,miR-26b inhibitor組細胞劃痕愈合率更高,同時si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組細胞劃痕愈合率明顯高于si-HAGLROS組(P<0.05)。si-NC組與si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組細胞劃痕愈合率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表7。

表7 SMMC-7721細胞劃痕愈合率

2.6 SMMC-7721細胞侵襲變化

與si-NC組比較,si-HAGLROS組細胞穿膜數目更低,miR-26b inhibitor組細胞穿膜數目更高,同時si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組細胞穿膜數目明顯高于si-HAGLROS組,差異均具有統計學意義(P<0.05)。si-NC組與si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組比較,P>0.05。見表8。

表8 細胞穿膜數目個)

2.7 EMT相關因子變化

與si-NC組比較,si-HAGLROS組N-cadherin、FN、Bcl-2表達更低,E-Cadherin表達更高,miR-26b inhibitor組E-Cadherin表達更低,N-cadherin、FN、Bcl-2表達更高,同時si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組N-cadherin、FN、Bcl-2表達明顯高于si-HAGLROS組,E-Cadherin明顯低于si-HAGLROS組,差異均具有統計學意義(P<0.05)。si-NC組與si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組E-Cadherin、N-cadherin、FN、Bcl-2比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表9。

表9 EMT相關因子變化

2.8 JAK2/STAT3通路因子變化

與si-NC組比較,si-HAGLROS組p-JAK2、p-STAT3表達更低,miR-26b inhibitor組p-JAK2、p-STAT3表達更高,同時si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組p-JAK2、p-STAT3表達明顯高于si-HAGLROS組,差異均具有統計學意義(P<0.05)。si-NC組與si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組p-JAK2、p-STAT3比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表10。

表10 JAK2/STAT3通路因子變化

3 討論

研究稱,腫瘤細胞發生侵襲和遷移是腫瘤惡化的前提條件[14]。EMT主要參與細胞轉移[15]。研究稱[16],EMT過程中,E-Cadherin表達異常下調,可引起極性下降,甚至喪失,上皮表型轉化為間質表型,N-cadherin、FN表達異常上調,促使腫瘤細胞遷移能力和侵襲能力增強。轉移前提為細胞獲取基質樣特性。多項研究均表明[17],LncRNAs調控EMT,參與腫瘤發展。Zhang等研究[18]發現高轉移性肝癌患者SNHG3活性激活后,一定程度上可促進肝癌細胞的侵襲能力,還可調控EMT過程。又有研究稱[19],DANCR可通過海綿作用與miR-27a-3p結合,進而調節EMT過程,促進肝癌疾病進展。又有研究稱[20],ID2-ASI阻斷HDAC8與ID2結合,調節ID2基因轉錄,進一步對EMT過程發揮調節作用,最終控制肝癌細胞的轉移。

多項研究均證實[21],LncRNA可競爭性內源RNA,作為miRNAs分子海綿,參與腫瘤疾病的發生和發展。本次研究結果發現,HAGLROS在肝癌細胞系中的表達明顯高于正常肝細胞系,說明HAGLROS可能參與了肝癌的發生和發展。本次研究還發現,miR-26b在肝癌細胞系中的表達較正常肝細胞的表達更低。生物信息學軟件顯示,HAGLROS與miR-26b具有靶向關系,說明HAGLROS與miR-26b存在靶向調控的關系。實驗證實,HAGLROS可調控miR-26b表達,且為負性調控。進一步進行細胞功能實驗發現,干擾HAGLROS表達后,細胞增殖活性、侵襲能力及遷移能力均明顯下降,同時EMT活性也下降,而沉默miR-126b表達后,細胞增殖、侵襲及遷移增強,EMT活性增加;干擾HAGLROS,沉默miR-126b,原本干擾HAGLROS表達后細胞增殖活性、侵襲能力及遷移能力下降而重新被激活。研究稱[22],HAGLROS通過miR-100/ATG14或PI3K/AKT/mTOR信號通路,影響鼻咽癌細胞自噬。又如Ye等的研究中[23],HAGLROS在肝癌組織中表達是健康組織的2.3倍。研究稱,肝癌內HAGLROS表達與腫瘤臨床分期、分化程度有關;HAGLROS可競爭性結合miR-5095,參與凋亡過程。上述研究均進一步表明HAGLROS參與肝癌的發生和發展。

JAK2/STAT3通路可參與多種腫瘤疾病。JAK2/STAT3通路與細胞生長、分化、凋亡有關。STAT3屬于一類致癌因子,可激活下游靶基因活性,進而參與細胞增殖,抑制凋亡,促進腫瘤發展。本研究結果顯示,干擾HAGLROS后,Bcl-2、p-JAK2、p-STAT3水平均明顯下降,而沉默miR-126b表達后,Bcl-2、p-JAK2、p-STAT3水平均明顯上升,但干擾HAGLROS表達且同時沉默miR-126b表達后,因干擾HAGLROS表達Bcl-2、p-JAK2、p-STAT3水平下降而又開始上升。此項研究結果說明HAGLROS可以通過靶向調控miR-126b,進而抑制JAK2/STAT3通路活性。

綜上所述,LncRNA-HAGLROS可通過靶向下調miR-26b促進肝癌細胞生物行為,如遷移、侵襲及EMT過程,同時可調控JAK2/STAT3通路活性,LncRNA-HAGLROS可作為肝癌治療靶點。但是本次研究也存在一些局限性,本研究僅僅在細胞層面探討了HAGLROS在肝癌中的作用,期待后續進行臨床研究以探討HAGLROS是否可作為肝癌預后標志物以及是否可作為肝癌患者治療靶點。