足細胞自噬機制和靶向信號通路相關研究進展*

陳 立,柳敏娜,趙欣怡,席春生△

(1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院腎臟內科,蘭州 730000;2.甘肅中醫藥大學第一臨床學院,蘭州 730000)

足細胞排列在毛細血管環的外側,通過錯綜復雜的足突網絡連接到腎小球基底膜。典型成熟足細胞可分為細胞體、主要突起、足突3個部分。足細胞的足突由裂孔隔膜細胞連接,在形成包裹腎小球交錯毛細血管網絡中發揮作用。每個裂孔隔膜的細胞一側都有一個電子密度高且富含蛋白質的區室結構,這對裂孔隔膜的完整性和信號轉導具有重要意義[1]。裂孔隔膜是防止蛋白丟失所建立的最后一道濾過屏障。足細胞在維持腎功能方面高度專一,并具有自噬活性以維持腎臟健康。當足細胞功能受損時,未過濾的大分子物質進入尿液,導致蛋白尿的形成。與腎小球系膜細胞和內皮細胞不同,足細胞損傷后無法有效地增殖和補充受損細胞,導致細胞數量進行性減少。自噬對足細胞、腎小管上皮細胞及健康腎臟中的免疫細胞動態平衡和生存至關重要。足細胞有絲分裂后與其他腎小球細胞相比具有更強的基礎自噬。這種細胞保護性質量控制機制有助于避免細胞退化。本文就足細胞損傷及自噬的可能機制和靶向信號通路綜述如下。

1 足細胞損傷

足細胞損傷是指足突肥大、扁平及消失。與腎小球的其他常駐細胞、系膜細胞和內皮細胞不同,足細胞不能進行適當的有絲分裂過程,足細胞缺乏后無法有效地增殖和補充受損細胞,導致足細胞數量進行性減少,對腎臟產生不可逆轉的損傷。足細胞是高度分化的終末細胞,更新能力有限,依賴于調節和組織肌動蛋白細胞骨架、細胞外基質來維持其復雜結構。這對足細胞施加了巨大的能量需求,使足細胞需要維持足夠的線粒體數量及適當的功能[2]。足細胞通過肌動蛋白細胞骨架以大量的腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)來維持足突表面積,而線粒體DNA和蛋白質的突變可能導致ATP丟失、濾過屏障的破壞等[3]。研究指出,足細胞和血管內皮細胞具有額外的線粒體功能,能控制脂肪酸代謝[4]。腎臟依靠線粒體脂肪酸代謝產生能量,一旦出現能量代謝障礙可引起腎臟足細胞、腎小管損傷。

2 足細胞自噬

自噬是一種保護機制[5]。其通過膜包裹部分細胞質和細胞中需要降解的細胞器、蛋白質來形成自噬體,自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解損傷蛋白質內容物,實現細胞內動態平衡。自噬的保護作用可以概括為提供能量來維持穩態,通過消除細胞中有缺陷的大分子和細胞器來修復細胞,在細胞的生存和維持中發揮著重要作用。因此,自噬的功能障礙導致了許多人類疾病的發生。

足細胞自噬是一種維持細胞內動態平衡的降解系統,作為一種高分化細胞在基礎水平下表現出高度自噬活性[6],也可作為慢性腎臟疾病的治療靶點[7]。足細胞的基礎自噬水平高于其他類型的腎小球細胞,是一種細胞保護的質量控制機制。自噬對腎細胞(如足細胞和腎小管上皮細胞)及健康腎臟中免疫細胞的動態平衡和生存至關重要。作為有絲分裂細胞,足細胞無法將潛在危險的細胞成分稀釋到其子代細胞中。為消除這些成分,足細胞需要較高的基線自噬水平。自噬的激活與足細胞損傷呈負相關,足細胞損傷是腎小球疾病蛋白尿進展的原因。對小鼠的研究表明,足細胞表現出有大量自噬小體及高水平自噬。足細胞特異性Atg5基因的缺失導致衰老小鼠的腎小球病變,其氧化、泛素化蛋白的積累及足細胞內質網應激最終導致足細胞損傷、蛋白尿增加和腎小球硬化[8-9]。

在腎臟中,需要生理水平的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)和腺苷5’-單磷酸活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase, AMPK)活性來支持腎細胞的生長和分化,并維持腎臟細胞完整性和正常腎單位功能,包括電解質、水和葡萄糖的轉運。足細胞自噬的調控機制復雜,其上游信號通路主要涉及mTOR依賴途徑和mTOR非依賴途徑。mTOR和AMPK在控制細胞生長、增殖、分化、代謝和存活方面具有關鍵作用,有助于腎臟在內的各種器官的生理發育和功能[10]。mTOR可形成兩種功能性多蛋白激酶復合物,mTOR復合體1(mTOR complex 1,mTORC1)和mTORC2[11-12]。mTORC1的過度激活導致足細胞和腎小管細胞功能障礙和易受損傷,從而促進慢性腎臟疾病的發展。靶向調控mTOR或AMPK途徑,可能是控制或預防這些疾病的有效治療方法(圖1)。

PLA2R:磷脂酶A2受體;SPAG5:精子相關抗原5;CFTR:囊性纖維化跨膜傳導調節因子;SGLT-2:鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2;TSC:結節性硬化癥復合體;NF-κB:核因子-κB;NLRP3:含NLR家族Pyrin域蛋白3;MAPK:絲裂原活化蛋白激酶;SPLA2-IB:分泌型磷脂酶A2 IB; TNT:隧道納米管;2DG:2-脫氧-D-葡萄糖。

3 足細胞自噬相關潛在信號通路

3.1 mTOR

mTOR信號通路的靶標在調節細胞生長、增殖、存活和代謝方面起著關鍵作用。mTOR信號失調與許多疾病有關,包括糖尿病、神經退行性疾病和癌癥。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,形成兩個較大多蛋白復合體的催化亞單位,即mTORC1和mTORC2。這兩種酶在自噬過程中發揮不同作用。mTOR信號傳導是通過控制UNC-51樣激酶1(UNC51-like kinase 1,ULK1)復合物和球形孢子絲菌液泡分選蛋白34(vacuolar protein sorting 34,VPS34)復合物的活性、TFEB/TFE3的細胞內分布和原溶酶體小管重建來調節自噬過程的多個方面[13]。研究人員用果蠅腎臟細胞建立足細胞模型,發現阻止mTOR信號傳導可致裂隙隔膜間距增加[14]。mTOR途徑激活的自噬保護足細胞免受細胞凋亡、足突消失和慢性腎臟疾病進展的影響。

在健康狀態下,腎小球足細胞通過維持低水平的mTOR基礎活性和高水平的基礎自噬活動來促進細胞更新,清除受損的細胞器、多余的脂類、長壽或錯誤折疊的蛋白質[15]。mTORC1活性可在體內誘導足細胞自噬,但長期雷帕霉素治療對足細胞mTORC1的基因抑制并不能實質上誘導自噬。在糖尿病腎病的早期階段,適當激活mTOR可保護足細胞免受損傷,并參與蛋白質合成和足細胞修復過程[16]。研究人員發現,抑制PLA2R后可激活足細胞中的PI3K/Akt/mTOR通路,有助于保護足細胞免受凋亡的影響,并為mTOR用于治療膜性腎病提供細胞學證據[17]。XU等[18]研究表明,SPAG5在膀胱尿路上皮癌中激活了Akt/mTOR信號通路,提示SPAG5可能調節自噬并在足細胞損傷中發揮作用。在高糖處理下,SPAG5 mRNA和蛋白表達水平均上調。沉默SPAG5可逆轉高糖處理的足細胞凋亡增加和自噬減少現象。ZHOU等[19]指出,自噬抑制劑加重了足細胞的損傷,表明足細胞自噬是狼瘡腎炎保護的靶點。此外,研究表明,mTORC1抑制劑、mTOR類似物可以在嚙齒動物模型中預防或延緩腎臟疾病的發生、發展[20]。

3.2 AMPK

AMPK是能量代謝的重要調節因子,由一個催化α亞基、β亞基和γ亞基組成的異源三聚體蛋白構成[10]。AMPK活化后可直接啟動自噬體磷酸化形成的關鍵分子ULK1并促進自噬,作用于多個下游靶點,通過抑制合成代謝過程和增加分解代謝過程來增加ATP的生成和減少消耗。mTOR抑制劑(如雷帕霉素類似物)和AMPK激活劑(如二甲雙胍)可特異性敲除動物模型和細胞培養物中的細胞作用,有較高的臨床價值。AMPK通過磷酸化ULK1刺激自噬。相反,mTORC1通過阻止ULK1的激活和擾亂AMPK與ULK1之間的相互作用來抑制自噬[21]。

二甲雙胍是一種口服治療糖尿病藥物,研究發現通過在小鼠模型中激活AMPK和抑制mTOR可改善細胞自噬,保護足細胞,減少蛋白尿,增加高血壓大鼠足細胞中血管內皮生長因子的產生,重建糖尿病大鼠腎臟中足細胞或腎上腺素的表達[22]。此外,二甲雙胍抑制CFTR介導和mTOR參與靶標。研究發現,SGLT-2抑制劑通過作用于TSC或氨基酸敏感機制來抑制mTORC1的活性,這種機制將導致mTORC1活性的特異性部分抑制,同時伴隨著AMPK的激活[23-24]。

山奈酚(kaempferol,KPF)具有促進自噬和抑制細胞凋亡的特性,通過增加AMPK和降低mTOR表達來調控AMPK/mTOR信號通路,減輕糖尿病蛋白尿和糖脂代謝功能障礙,緩解腎小球基底膜增厚及足細胞的丟失或融合[25]。Sestrin2是多種信號通路的上游信號分子,具有增強細胞自噬、減弱內質網應激、強化氧化防御調節細胞穩態的作用。在糖尿病動物模型中Sestrin2高表達,不僅會阻礙糖尿病腎上皮-間充質轉化和細胞外基質積累,還能增強AMPK、Nrf2信號傳導及抑制mTORC1表達,改善足細胞損傷、系膜增生、蛋白尿和腎纖維化,延緩糖尿病腎病發展[26]。

3.3 sirtuins(SIRT)

SIRT是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性脫乙酰酶,包括SIRT1～7。SIRT活性與DNA修復、細胞凋亡、細胞存活和發育、炎癥和健康衰老有關[27]。SIRT對足細胞損傷相關的腎小球疾病有多效性保護作用,如改善免疫炎癥狀態和氧化應激水平、維持線粒體穩態、增強自噬和調節脂質代謝[28]。激活SIRT對不同足細胞損傷相關的腎小球疾病具有保護作用,包括糖尿病腎病、局灶節段性腎小球硬化癥、膜性腎病、免疫球蛋白A(IgA)腎病和狼瘡性腎炎。研究表明,這些效應與SIRT1的蛋白質量和活性降低、AMPK磷酸化降低相關[29-30]。

LIU等[31]發現,在兩個獨立的小鼠模型中,SIRT6通過對Notch信號的表觀遺傳調節來保護足細胞。SIRT6在足細胞中具有多效性保護作用,包括抗炎和抗凋亡作用,并參與肌動蛋白細胞骨架維持和自噬促進。其中,SIRT6通過去乙酰化組蛋白H3K9促進Notch1和Notch4的轉錄。研究報道,叉頭框蛋白M1(forkhead box M1,FOXM1)對急性腎損傷具有保護作用,改善了小鼠的腎功能,增加了腎組織中足細胞標志物腎病蛋白的表達[32]。FOXM1與SIRT4的啟動子結合可以誘導轉錄激活,反之,下調SIRT4可阻斷FOXM1在體內和體外的保護作用。FOXM1轉錄激活SIRT4并抑制NF-κB信號傳導和NLRP3炎癥小體,以減輕糖尿病腎病的腎損傷和足細胞損傷。這些發現均表明SIRT是預防足細胞損傷潛在治療靶點之一。

3.4 MAPK

MAPK信號通路是真核細胞功能的高度保守調節劑[33],調節細胞周期、細胞凋亡、分化、蛋白質生物合成和腫瘤發生等多個生物過程。激酶使MAPK磷酸化,啟動和控制激活幅度。相反,MAPK磷酸酶使MAPK去磷酸化,下調和控制信號的持續時間。

研究發現,特發性膜性腎病患者的SPLA2-IB和M型磷脂酶A2受體水平明顯高于非腎病蛋白尿者,自噬小體明顯少于非腎病蛋白尿者[34]。在體外,SPLA2-IB誘導足細胞自噬不足,并通過激活p38 mTOR/ULK1ser757信號通路促進足細胞損傷。抑制p38 MAPK明顯抑制了SPLA2-IB誘導的自噬和mTOR/ULK1ser757的激活。用siRNA干擾PLA2R的表達明顯減弱了SPLA2-IB對足細胞自噬的影響。SPLA2-IB通過激活p38 MAPK/mTOR/ULK1ser757信號通路下調特發性膜性腎病足細胞自噬。MAPK通路可以誘導細胞在不同類型的細胞中自噬[35],自噬在防御脂多糖誘導的足細胞損傷中發揮了積極的作用,證明lncRNA牛磺酸上調基因1(lncRNA taurine-upregulated gene 1,TUG1)通過激活MAPK通路靶向miR-197對內毒素誘導的足細胞損傷具有保護作用。

3.5 肌動蛋白細胞骨架通路

在足細胞中,自噬是一種自穩機制,有助于肌動蛋白細胞骨架形態和功能完整性的形成和保持。足細胞損傷以細胞骨架重塑和足突融合為特征。在體內,鳥氨酸脫羧酶抑制劑即二氟甲基鳥氨酸(difluoromethylornithine,DFMO)可減少小鼠的尿白蛋白排泄,減輕足細胞足突融合。2-DG誘導足細胞mTOR信號激活和細胞骨架重塑,鳥氨酸脫羧酶基因敲除可減輕這一作用。從機制上,鳥氨酸分解代謝的代謝產物腐胺可以激活GTP酶Ras同系物,后者為mTOR信號的感受器,表明糖尿病條件下足細胞糖酵解受損可增強鳥氨酸分解代謝,鳥氨酸分解代謝產物激活mTOR信號,促進糖尿病腎病足細胞骨架重構。

4 其他信號通路

新出研究表明,Breviscapine(Bre)對糖尿病大鼠具有腎保護作用[36]。在鏈脲佐菌素誘導糖尿病腎病的試驗小鼠模型中發現Bre能大幅提高足細胞活力,改善足細胞損傷,如α-平滑肌肌動蛋白表達減少。Bre通過抑制NF-κB/NLRP3-mediated信號通路介導細胞凋亡,減輕高糖誘導的足細胞損傷并改善了糖尿病小鼠的腎功能。

TNT是一種開放式通道,可遠距離連接細胞。細胞在受到刺激時,細胞間可形成TNT將細胞分組(如小細胞器)轉移至受損細胞,通過替換受損的細胞器以增加受體細胞對損傷的抵抗力。細胞質蛋白腫瘤壞死因子α誘導蛋白2(tumor necrosis factor alpha induced protein 2,TNFAIP2)在TNT形成中發揮關鍵作用,TNT是瞬時連接細胞的膜通道,允許細胞器轉移[37]。TNFAIP2過表達增強了TNT介導轉移,并阻止了晚期糖基化終產物誘導的自噬、溶酶體功能障礙和細胞凋亡。TNFAIP2通過允許TNT介導的自噬體和溶酶體交換,對糖尿病腎病背景下的足細胞中起重要的保護作用,并且可能代表一種新的藥物靶標。

5 小結與展望

足細胞自噬可能是預防足細胞損傷和蛋白尿的潛在治療靶點。自噬能及時清除異常積累蛋白質、功能失調的細胞器、入侵的細菌,以維持細胞的正常生理功能。自噬在其他足細胞相關疾病(如微小病變性疾病和局灶節段性腎小球硬化)中的作用仍有待研究。SIRT在調節mTOR信號通路、AMPK、自噬激活及足細胞健康相關的各種關鍵通路和代謝中發揮了關鍵作用。為評估靶向細胞自噬是否是預防和治療腎臟疾病的關鍵,還需要進行更多基礎臨床研究,以幫助臨床開發針對足細胞自噬功能的靶向藥物。