GSK-3介導的信號通路在類風濕關節炎中的作用的研究進展*

陸 婷,蔣 總,蘭維婭,唐 芳

(1.貴州中醫藥大學,貴陽 550002;2.貴州中醫藥大學第二附屬醫院風濕免疫科,貴陽 550003)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種自身免疫性骨關節疾病,以慢性炎癥、滑膜細胞異常增生為特征,可引起關節炎癥和骨破壞,導致關節功能受限[1]。在RA的發展過程中,許多不同的信號通路發揮著重要作用。因此,對RA病理機制的深入研究有助于有效的抗類風濕藥物的開發。糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)是一種能誘導和終止炎癥的激酶,廣泛存在于各種炎癥細胞中,參與多種信號通路的調節[2]。雖然RA的發病機制尚不清楚,但研究證實RA患者自身免疫活躍,炎癥趨化因子異常刺激,促使炎癥因子水平升高而加快RA病情進展,而促炎細胞因子的產生主要依賴于GSK-3的活性,RA中觀察到的炎癥因子與各種促炎介質和轉錄因子已被證明與GSK-3密切相關[3]。同時也有較多信號通路被異常激活或抑制,其涉及多種蛋白的異常表達,而GSK-3就是比較重要的一種,所以RA的治療可能側重于減少免疫反應和炎癥反應[4]。GSK-3β在RA中研究較充分,因此本文總結了關于GSK-3β與RA的相關炎癥因子緊密聯系的Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)、磷酸酰肌醇3激酶(phosphotylinosital 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)及核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路機制的探討,以期為RA的治療提供更多的理論依據。

1 GSK-3概述

GSK-3最早是從兔骨骼肌中分離得到,并在哺乳動物中鑒定出兩種高度同源的GSK-3,即GSK-3α和GSK-3β。氨基酸序列比較表明,二者在催化區域有98%的同源性,而整體同源性約為85%。GSK-3α和GSK-3β在調控和表達上存在一定差異,具有共同或不同的底物和細胞功能,不能完全替代對方,其主要表現在于N和C端不同,GSK-3α和GSK-3β分子量的差異是由GSK-3α N端富含甘氨酸的延伸引起的。而GSK-3α和GSK-3β C端最后76個氨基酸的同源性僅為36%[2,4]。在調控上,GSK-3活性被絲氨酸(Ser)21、Ser9磷酸化而抑制和被蘇氨酸(Tyr)279、Tyr216磷酸化而激活。同時,研究證實GSK-3α敲除小鼠可以存活,但GSK-3β缺失會導致胚胎死亡[3],表明GSK-3α和GSK-3β的功能不完全相同。

GSK-3活性受自身磷酸化水平的影響,除最早發現的能調控糖原合成酶的活性外,GSK-3還作用于眾多信號通路和轉錄因子中,調節細胞的分化、增殖、存活和凋亡[2]。同時GSK-3作為眾多信號通路下游的關鍵因子,可廣泛參與細胞過程,如從糖原代謝到血管生成、細胞生存和炎癥反應的調節等[4]。GSK-3在炎癥和免疫疾病中參與調節炎癥因子,如白細胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等[3]。

2 不同信號通路對RA的影響

2.1 Wnt/β-catenin信號通路

Wnt信號通路與RA的發生、發展密切相關。經典信號通路在缺乏Wnt配體參與時,GSK-3β與軸蛋白/結腸腺瘤樣息肉病基因編碼的蛋白/酪蛋白激酶1形成降解復合體,磷酸化β-catenin,β-catenin被泛素蛋白酶識別并降解,抑制Wnt信號通路的激活。當Wnt配體參與時,其與卷曲蛋白(frizzled,FZD)和單跨膜分子低密度脂蛋白受體相關蛋白(low density lipoprotein-related protein,LRP)5/LRP6形成Wnt/FZD/LRP復合體,招募散亂蛋白,捕獲軸蛋白(Axin)結合的GSK-3β復合物,穩定β-catenin并使其進入細胞核,與T細胞因子(T cell factor,TCF)/淋巴樣增強因子(lymphoid enhancer factor,LEF)轉錄因子家族相互作用,激活下游靶基因而發揮作用[5]。

Wnt/β-catenin信號通路通過促進細胞增殖、遷移、侵襲和炎癥參與RA成纖維細胞樣滑膜細胞(fibroblastlike synoviocyte,FLS)的激活,激活的FLS可產生和分泌TNF-α、IL-1β、IL-8等炎癥因子,最終導致滑膜炎和關節損傷,而FLS產生的炎癥因子也能激活Wnt信號通路,導致RA的炎癥反應[6]。Wnt5a、Wnt7a、Wnt10b作為Wnt/β-catenin信號通路的配體,能在FLS的增殖過程中大量釋放炎癥因子,加快RA病情進展[7]。Wnt1是纖維連接蛋白(fibronectin,Fn)生成的主要Wnt配體之一,能夠調節RA-FLS中β-catenin下游Fn的表達,而Fn提高了FLS的生存,從而加重了RA的炎癥反應[6]。RA-FLS作為滑膜組織中參與RA發展的主要細胞群,抑制RA-FLS的侵襲、遷移和炎癥可作為治療RA的手段之一。除炎癥作用外,Wnt信號通路在RA成骨細胞(osteoblast,OB)和破骨細胞(osteoclast,OC)的平衡中具有重要的調節作用。(1)Dickkopf-1(DKK1)作為Wnt/β-catenin信號通路的拮抗劑在RA中能加劇FLS介導的炎癥、骨破壞和血管生成,當其在RA患者的血清和滑膜液中過表達時,通過抑制Wnt/β-catenin信號通路而抑制OB分化,間接使OC分化增加,加劇RA患者的骨破壞[7]。(2)Wnt/β-catenin信號通路對骨保護素(osteoprotegerin,OPG)/核因子-κB配體受體激活劑(oeceptor activatorfor nuclearfactor-κB ligand,RANKL)的表達起重要調控作用,Wnt/β-catenin信號通路能增強OPG的表達,而RANKL誘導OC生成,OPG通過阻斷RANKL與RANK的結合抑制OC生成,改善RA的骨破壞。(3)DKK1通過抑制OPG的過表達,提高RANKL水平,抑制Wnt/β-catenin信號通路對OB和OC的調節,保持RA骨代謝的穩態[8]。

RA的發病機制較復雜,目前仍處于研究階段,而Wnt/β-catenin信號通路上不同因子通過不同的機制作用于RA,也從不同方面影響著RA的進展及預后。

2.2 GSK-3β介導的Wnt/β-catenin信號通路

GSK-3作為關鍵的調控因子,同時也被多種因子調節。最常見的是GSK-3β結合蛋白,在體內的功能是穩定β-catenin。Axin與抗原提呈細胞(antigen-presenting,APC)作為GSK-3β的底物,GSK-3β能磷酸化Axin并提高其穩定性,同時更有利于β-catenin與APC之間的相互作用,使GSK-3β磷酸化β-catenin[9]。因此,GSK-3在Wnt/β-catenin信號通路中主要由GSK-3β參與進行磷酸化,GSK-3β在β-catenin降解復合體中作為一個關鍵酶,能夠調控Wnt信號通路的激活或失活。進一步說明了GSK-3在Wnt/β-catenin信號通路中的中心作用。

微RNA-26b(miR-26b)在抑制RA的滑膜炎中發揮核心作用。研究證實,miR-26b通過降低GSK-3β水平使Ser9-GSK-3β磷酸化水平下降而提高β-catenin和細胞周期蛋白1(CyclinD1)表達,抑制Wnt/GSK-3β/β-catenin信號通路,減少RA-FLS增殖和炎癥因子分泌而抑制RA滑膜炎[10]。氯化鋰(LiCl)作為GSK-3β抑制劑,可以增強GSK-3β在Ser9位點的磷酸化水平并促進β-catenin在核內的積累,而7-羥基香豆素(7-HC)在體外阻止β-catenin的核轉位。LiCl與7-HC聯合使用恢復了β-catenin信號通路的活性,并抑制7-HC對TNF-α誘導的RA-FLS的抗增殖和促凋亡作用,說明7-HC抗RA進展是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路介導[11]。所以,GSK-3β通過介導Wnt/β-catenin信號通路可以誘導RA的進展,進一步表明GSK-3β在Wnt/β-catenin信號通路中不可忽視的作用。

2.3 PI3K/Akt信號通路

PI3K主要由p110催化亞單位和p85調節亞單位組成。PI3K可被G蛋白偶聯受體和(或)蛋白酪氨酸激酶受體激活,也可被Ras蛋白激活。Akt作為PI3K信號通路的下游靶點,當PI3K激活后在質膜上將磷脂酰肌醇(4,5)二磷酸[phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate,PIP2]磷酸化并產生磷脂酰肌醇(3,4,5)三磷酸[phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate,PIP3],Akt的PH結構域與PIP3結合,PIP3依賴性激酶-1在被PIP3活化的同時定位于細胞膜,進一步催化Akt的Thr473和Thr308磷酸化,Akt由此被完全活化,活化的Akt使大量下游底物磷酸化,參與調節細胞存活、凋亡、增殖等[12]。

PI3K/Akt信號通路在RA中參與了多個環節的發生,如調控炎癥因子的釋放,促進OB的生成等。PI3K/Akt信號通路的異常激活是RA的主要調節因子,能誘導RA炎癥反應的發生,而炎癥因子也能通過激活PI3K/Akt信號通路來介導RA的進展[8]。PI3K/Akt可以通過作用于雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制RA-FLS自噬,使FLS異常增殖,加重RA病情[7]。同時,PI3K/Akt信號通路抑制劑或者通過上調其內源性負調節蛋白的水平,而抑制RA-FLS增殖,緩解RA的發展[11]。RA-FLS通過產生TNF-α、IL-6、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基質金屬蛋白酶誘導炎癥反應,導致PI3K/Akt信號通路轉導異常,引起滑膜炎和FLS釋放,最終導致RA的軟骨破壞和骨侵蝕,影響OB的分化和生成[8]。VEGF作為血管生成的關鍵調控因子,能誘導RA滑膜中的促炎細胞因子產生,而PI3K/Akt信號通路在炎癥反應及缺氧下能夠促進VEGF的表達。研究證實,紫草素通過下調PI3K/Akt信號通路抑制VEGF誘導的血管生成,從而緩解RA滑膜炎和血管翳的形成[13]。通過調控PI3K/Akt信號通路相關蛋白可以誘導RA-FLS細胞凋亡,控制RA的癥狀和發展[11]。PI3K/Akt信號通路可從不同作用、不同方面緩解RA的炎癥反應。

2.4 GSK-3介導的PI3K/Akt信號通路

GSK-3作為PI3K/Akt途徑的下游成分,當PI3K/Akt激活時使Ser21處的GSK-3α和Ser9處的GSK-3β磷酸化,導致GSK-3失活。在特定情況下Akt和GSK-3可以協同調控信號通路,GSK-3也可以調節一些GSK-3抑制激酶的作用。這種雙向性的研究主要集中在Akt和GSK-3的相互作用中,Akt不僅抑制GSK-3,而且GSK-3也可以調控Akt,如GSK-3α還可以通過Ser312-Akt調控位點的磷酸化抑制Akt的活性[14]。IL-10是一種抑制炎癥基因表達的免疫抑制細胞因子,PI3K/Akt信號通路能誘導其產生,而Akt下游的GSK-3激酶作為IL-10的抑制劑,當GSK-3磷酸化和失活時使IL-10從GSK-3的抑制中釋放出來并過表達,抑制促炎細胞因子,增強抗炎機制,緩解RA的炎癥反應[15]。

SHARMA等[16]通過藥理實驗證實,小檗枸杞提取物(BLFE)和小檗堿的PI3K、Akt激活均減弱,而GSK-3β激活僅在BLFE和小檗堿給藥組觀察到抑制。GSK-3β在PI3K/Akt信號通路中能改善RA的臨床癥狀,為PI3K/Akt-GSK-3信號通路治療RA提供了新的方向及理論依據。

2.5 NF-κB信號通路

NF-κB是一種由3個亞基[p65、p50和抑制劑kappa B(IκB)]組成的轉錄因子,多種細胞內外刺激可直接或間接激活NF-κB信號通路。NF-κB信號通路由兩種途徑進行激活:(1)典型的NF-κB信號通路由促炎信號(細胞因子受體,如IL-1R和TNF-α家族)、Toll樣受體(TLR)和淋巴細胞受體參與激活。其傳導的關鍵是三聚體IκB激酶復合物對IκBα的磷酸化,以釋放RelA:p50二聚體,使其易位到細胞核以激活靶基因。(2)非典型的NF-κB信號通路,由NF-κB的必要調節蛋白(NEMO)和催化激酶亞基(IKKβ)獨立的IKKα二聚體復合物介導,從而間接激活與之相關的其他細胞途徑,如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、免疫球蛋白(Rho)等[17]。NF-κB信號通路被認為是細胞因子與炎癥反應之間的橋梁,而RA作為一種炎癥相關疾病與NF-κB信號通路的過度激活有關[18]。NF-κB信號通路作為RA的主要炎癥途徑之一,在所有細胞類型中普遍表達和被激活,并與其他信號通路之間相互作用,在調節炎癥、免疫和細胞增殖、分化、生存方面發揮著關鍵作用。高度激活的NF-κB信號通路可誘導多種促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的產生,從而加速RA的進展。而促炎細胞因子的上調也可以通過正反饋調節NF-κB信號通路的激活,形成惡性循環,加速RA的發展[19]。

活化的NF-κB信號通路可促進FLS增殖,增強其侵襲、浸潤能力。在RA的滑膜炎環境中,FLS凋亡異常是RA滑膜增生的主要因素。凋亡異常的FLS進一步聚集并黏附在軟骨和骨上,加劇關節軟骨和骨的破壞[18]。而NF-κB信號通路的過度激活會導致RA中FLS凋亡異常,相反,抑制NF-κB可明顯減輕炎癥反應[20]。藥理實驗證實,早期RA患者的炎癥可使用氨甲蝶呤(MTX)來治療,MTX治療由NF-κB信號通路介導,MTX可以通過增加RA患者NF-κB抑制物A20(TNFAIP3)的表達來抑制巨噬細胞的炎癥反應[21]。而潑尼松龍是一種合成糖皮質激素,通過NF-κB信號通路抑制炎癥基因激活,臨床上用于緩解RA的炎癥治療[22]。可見,臨床上通過藥物來抑制NF-κB信號通路,或者通過該通路抑制相關炎癥因子的表達,進一步改善RA的進展。

2.6 GSK-3介導的NF-κB信號通路

RA患者炎癥細胞因子表達較高,它們既是NF-κB信號通路的靶基因,又是激活因子。TNF-α能夠調節GSK-3,促進NF-κB信號通路反饋抑制,使炎癥細胞因子減少。而GSK-3β參與多種事件,如激活NF-κB信號通路、阻止IκB的降解、抑制p65的核轉位及降低p65的磷酸化水平[4]。說明抑制GSK-3β可抑制NF-κB信號通路的激活。而GSK-3β可以選擇性激活NF-κB信號通路,如NF-κB介導的IL-6和單核細胞趨化蛋白-1的表達需要GSK-3β才能有效表達,而IκBα和巨噬細胞炎癥蛋白-2則不需要。GSK-3β對NF-κB信號通路誘導的基因表達的這種選擇性作用可能有助于GSK-3抑制劑的抗炎作用,同時表明GSK-3的抑制不會干擾NF-κB信號通路的所有作用[23]。

研究發現,在RA小鼠模型中隨著NF-κB信號通路的激活,炎癥細胞因子表達增加,使用GSK-3β抑制劑TDZD-8后,下調了RA-FLS中NF-κB信號通路,抑制了c-Jun N末端激酶(JNK)、c-Jun、活化轉錄因子(ATF)2和p38的表達,從而抑制RA的炎癥反應[24]。NF-κB信號通路是一種有效的炎癥因子和轉錄因子,在膠原誘導性關節炎(CIA)的動物模型中GSK-3β和NF-κB信號通路的同時激活是RA動物炎癥和滑膜增殖過程中的主要關鍵因素,在RA動物模型中,GSK-3β的抑制通過抑制NF-κB信號通路的激活提供保護[20]。藥理實驗表明,阿托伐他汀和槲皮素的聯合治療進一步促進了miR-26b和miR-20a表達的升高,從而抑制GSK-3β/NF-κB/活化的NOD樣受體蛋白3(NLRP-3)信號通路,導致促炎細胞因子的減少,在RA中發揮抗炎作用[25]。

NF-κB信號通路可以被一個或多個復雜的信號通路激活,這些信號通路之間也可以相互影響。GSK-3β對NF-κB信號通路具有不同的調節作用,主要以其對RA炎癥作用為主,但相關實驗研究較少,所以在RA中的作用機制需進一步探討。

3 小 結

RA發病機制復雜,目前仍不能明確其發病機制。而信號通路為RA的治療提供了明確的治療靶點,Wnt/β-catenin、PI3K/Akt及NF-κB信號通路與炎癥因子相互作用共同促進RA的發展。GSK-3作為一種能夠調節多種靶分子絲氨酸和蘇氨酸氨基酸殘基磷酸化的激酶,參與許多細胞調節過程,并在多個不同的信號通路中有助于緩解炎癥。而使用GSK-3β抑制劑作用于特定信號通路可抑制RA的炎癥反應,表明抑制GSK-3β可以有效治療RA,為治療RA提供了新的方向,但其安全性還需要大量的臨床研究進一步評估。GSK-3β在RA中研究較充分的是其抗炎作用,而GSK-3β對其他風濕病的具體作用機制研究較少,還需進一步研究,以期為風濕病的治療提供更多的理論依據。