槲皮素對大鼠心肌梗死后左心室重塑的改善機(jī)制研究*

羅 建,朱 彬△,劉應(yīng)才,范新榮,魏 燕

(1.瀘州市中醫(yī)醫(yī)院心血管內(nèi)科,四川瀘州 646000;2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,四川瀘州 646000;3.西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所,四川瀘州 646000)

心室重塑是心室應(yīng)對心臟負(fù)荷狀態(tài)而發(fā)生的慢性結(jié)構(gòu)改變,表現(xiàn)為心臟大小、形態(tài)和功能發(fā)生改變,臨床上最終導(dǎo)致心力衰竭,給患者及社會帶來巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。心室重塑分為向心性、離心性及心肌梗死(myocardial infarction,MI)后重塑,其中MI是心室重塑的首要危險(xiǎn)因素,主要集中在高血壓、肺動脈高壓、主動脈瓣狹窄、糖尿病等方面[1]。MI后心室重塑機(jī)制與炎癥反應(yīng)、機(jī)械刺激、心肌肥厚、心肌纖維化、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活、交感神經(jīng)興奮、氧化應(yīng)激、能量代謝異常等相關(guān)[2]。目前,臨床上逆轉(zhuǎn)MI后心室重塑的主要藥物包括炎癥細(xì)胞因子抑制劑、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)阻斷劑、交感神經(jīng)受體阻斷劑、鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑、他汀等[3]。槲皮素(quercetin,Que)是自然中一種常見的黃酮類化合物,有研究表明其可通過抑制炎癥等機(jī)制對心臟產(chǎn)生保護(hù)作用[4-8],也可降低腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的釋放來減少大鼠心肌缺血再灌注損傷[9]。由于MI后心室重塑與心肌缺血再灌注損傷有大致相同的發(fā)病機(jī)制[10],故推測Que對MI后心室重塑亦具有保護(hù)作用。因此,本研究探討Que對大鼠MI后心室重塑的保護(hù)作用及其對TNF-α和IL-6的影響,并為臨床上治療MI后心室重塑的新藥開發(fā)提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

30只健康清潔級SD雄性大鼠購于四川達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司[動物合格證號:SCXK(川)2015-030],8周齡,體重約200 g。所有大鼠于動物房中飼養(yǎng),環(huán)境溫度20～24 ℃,濕度45%～50%,12 h光照和12 h暗循環(huán),保持環(huán)境通風(fēng),及時(shí)清理糞便,更換墊料,提供充足飲水及飼料,適應(yīng)飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器與試劑

槲皮素購于德國默克公司;TNF-α、IL-6抗體及其對應(yīng)ELISA試劑盒均購于武漢博士德生物公司;Masson染色試劑盒及SP免疫組織化學(xué)染色(IHC)試劑盒購于四川源康盛科技有限公司;小動物呼吸機(jī)及氣體麻醉機(jī)購于深圳瑞沃德生命科技有限公司;切片機(jī)及包埋機(jī)購于德國徠卡儀器有限公司;數(shù)字切片掃描儀(KF-PRO-002)購于寧波江豐生物信息技術(shù)有限公司;FUJIFILM Vevo 3100高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)購于日本富士膠片公司;Cytation 5多功能酶標(biāo)儀購于美國伯騰儀器有限公司;低溫高速離心機(jī)購于德國艾本德股份公司。

1.3 方法

1.3.1喂養(yǎng)與分組

將大鼠隨機(jī)分為Sham組、MI組、Que組,每組各10只。采取結(jié)扎左前降支的方法制造大鼠急性MI模型,術(shù)前12 h禁食,自由飲水。異氟烷氣體持續(xù)麻醉大鼠,經(jīng)口行氣管插管,呼吸機(jī)輔助呼吸,連接心電圖機(jī)持續(xù)監(jiān)護(hù),后行開胸手術(shù),在左心耳與肺動脈圓錐之間找到冠狀動脈,在左心耳下方2～3 mm處用絲線永久性結(jié)扎冠狀動脈,觀察心電圖變化。結(jié)扎線以下區(qū)域可見顏色變白,心肌收縮減慢,同時(shí)Ⅰ導(dǎo)聯(lián)、aVL導(dǎo)聯(lián)ST段向上抬,并且出現(xiàn)頻發(fā)的室性心律失常,則提示結(jié)扎成功,仔細(xì)縫合傷口并消毒。Sham組只穿線,不結(jié)扎。Que組在制造MI模型后每天予以Que 100 mg/kg口服,MI組及Sham組普通喂養(yǎng),連續(xù)喂養(yǎng)4周。

1.3.2心臟超聲檢查

末次喂養(yǎng)24 h后,異氟烷氣體持續(xù)麻醉大鼠,在標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置下進(jìn)行二維經(jīng)胸超聲心動圖檢查,在3個(gè)連續(xù)的心動周期內(nèi)測量并計(jì)算出左心室舒張末期容量(LVEDv)、左心室收縮末期容量(LVESv)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室短軸縮短率(LVFS)。

1.3.3血清炎癥細(xì)胞因子檢測

超聲檢查結(jié)束后,開胸行心臟采血,于4 ℃、3 000 r/min離心10 min,收集上清液,按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行血清TNF-α和IL-6水平檢測。

1.3.4Masson染色評估大鼠心肌纖維化

采血完成后,立即取心臟置于4%多聚甲醛中固定12 h,然后經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟后使用組織包埋機(jī)包埋,再使用組織切片機(jī)切片。心臟采用橫切面,從左心耳下方2～3 mm處心室往心尖方向切片,厚度約為5 μm。將切片固定于載玻片。心臟切片脫蠟,反復(fù)水洗,蘇木精液染核,麗春紅復(fù)紅,苯胺藍(lán)藍(lán)染,冰醋酸浸洗,乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固,完成Masson染色。

1.3.5IHC染色觀察心肌炎癥細(xì)胞因子水平

根據(jù)SP試劑盒說明書,心臟石蠟切片脫蠟,修復(fù)抗原,清除內(nèi)源性過氧化氫酶,封閉抗體,分別加入1∶500的TNF-α和IL-6一抗,4 ℃過夜,二抗孵育,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片,完成IHC染色。

1.3.6切片掃描

所有切片采用數(shù)字切片掃描儀掃描,并導(dǎo)出圖片進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Que改善MI后左心功能

心臟超聲結(jié)果提示,與Sham組比較,MI組大鼠LVEF和LVFS均明顯降低,LVEDv和LVESv均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與MI組比較,Que組左心功能明顯改善,LVEF和LVFS均明顯升高,LVESv明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1、圖1。

圖1 各組心臟超聲圖

表1 各組間心臟超聲結(jié)果比較

2.2 各組左心室心肌纖維化情況比較

MI組較Sham組左心室心肌纖維化程度升高,而Que組較MI組左心室心肌纖維化程度降低,見圖2。

紅色為正常心肌組織,藍(lán)色為纖維化心肌組織。

2.3 各組血清及心肌組織炎癥細(xì)胞因子水平比較

與Sham組比較,MI組大鼠血清TNF-α和IL-6水平均明顯升高(P<0.05),心肌組織中TNF-α和IL-6浸潤均明顯增多;與MI組比較,Que組大鼠血清IL-6和TNF-α水平均明顯降低(P<0.05),心肌組織中TNF-α和IL-6浸潤均明顯減少,見表2、圖3～4。

圖3 各組IL-6的IHC染色結(jié)果(40×)

圖4 各組TNF-α的IHC染色結(jié)果(40×)

表2 各組間ELISA及IHC結(jié)果比較

3 討 論

機(jī)體遭受急性MI后,立即發(fā)生應(yīng)激性炎癥反應(yīng),旨在清除壞死心肌細(xì)胞,隨后進(jìn)入抗炎階段,表現(xiàn)為纖維化修復(fù)心臟,防止發(fā)生急性心臟破裂等并發(fā)癥,但卻最終導(dǎo)致心室重塑,進(jìn)一步甚至?xí)M(jìn)展為心力衰竭[11]。

MI后機(jī)體受到心肌局部炎癥細(xì)胞因子浸潤和全身神經(jīng)炎癥反應(yīng)雙重攻擊,這是MI后心室重塑的重要機(jī)制之一[12]。參加大鼠MI后心室重塑的促炎因子主要有TNF-α和IL-6[13]。JING等[14]發(fā)現(xiàn),IL-6基因敲除小鼠MI后心肌中的TNF-α表達(dá)會明顯下調(diào),且可通過激活M2巨噬細(xì)胞和減少成纖維細(xì)胞膠原蛋白生成來改善心臟重塑。WANG等[15]證實(shí)IL-6在急性MI大鼠模型中可刺激心肌纖維化,最終導(dǎo)致心室重塑,而IL-6抑制劑可逆轉(zhuǎn)此過程。CEN等[16]發(fā)現(xiàn)麝香保心丸通過下調(diào)MI大鼠TNF-α和IL-6的表達(dá),進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化,改善心功能和心室重塑。此外,急性MI患者血液中TNF-α和IL-6水平明顯升高,卡托普利和纈沙坦可有效降低炎癥水平,改善患者心室重塑[17]。

有研究證明,50、100、400 mg·kg-1·d-1的Que連續(xù)喂養(yǎng)大鼠7 d均可降低MI大鼠循環(huán)中TNF-α水平,具有抗炎、抗氧化和抗凋亡作用,可有效降低心肌損傷[18-19]。ALBADRANI等[20]發(fā)現(xiàn),50 mg/kg的Que連續(xù)喂養(yǎng)大鼠30 d可逆轉(zhuǎn)大鼠MI后左心室重塑,其主要通過心肌組織轉(zhuǎn)化生長因子β1/Smad3通路來實(shí)現(xiàn)。王興紅等[21]研究發(fā)現(xiàn),予以30、60 mg·kg-1·d-1的Que連續(xù)灌胃7 d預(yù)處理心肌缺血再灌注大鼠,可明顯降低大鼠血液中TNF-α和IL-6水平,減少M(fèi)I面積。LIU等[22]發(fā)現(xiàn),再灌注時(shí)予以10 nmol/L的Que灌注10 min后,可明顯降低大鼠缺血再灌注模型冠狀動脈流出液中TNF-α和IL-6水平,改善心功能。劉振華等[23]發(fā)現(xiàn),再灌注前15 min靜脈注射10 mg/kg的Que可明顯降低大鼠心肌缺血再灌注模型循環(huán)中的IL-6水平。何亞磊等[24]采用25、50、100 mg·kg-1·d-1的Que連續(xù)喂養(yǎng)大鼠7 d制造心肌缺血再灌注模型,發(fā)現(xiàn)血液中TNF-α和IL-6水平明顯降低,MI面積明顯減少。LIU等[25]采用250 mg/kg的Que預(yù)處理大鼠心肌缺血再灌注模型,發(fā)現(xiàn)可明顯降低其循環(huán)中的TNF-α水平。這與本研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn),Que可改善MI大鼠LVEF及LVFS,降低LVESv及左心室心肌纖維化程度,明顯改善大鼠MI后左心室重塑[26];此外,Que明顯降低MI大鼠循環(huán)中及心臟組織中TNF-α和IL-6表達(dá)水平,說明Que減輕大鼠MI后左心室重塑機(jī)制可能還與抑制炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的釋放相關(guān)。但是本研究局限于動物實(shí)驗(yàn),且研究樣本較少,需進(jìn)一步開展更大規(guī)模的臨床研究,為臨床新藥開發(fā)提供更充實(shí)的理論依據(jù)。