鳶尾素激活PGC-1α、UCP-1促進噬脂和褐變抑制ACHN細胞增殖和遷移*

熊紹風,熊小偉,彭國平,王 昆,方 洋,呂燕妮△

(1.南昌大學第一附屬醫院藥學部,南昌 330000;2.南昌大學藥學院藥理教研室,南昌 330000;3.江西應用科技學院,南昌 330100)

腎細胞癌是一種起源于腎小管上皮細胞的癌癥,在腎惡性腫瘤中占比高達90%以上[1],且統計發現,腎細胞癌占所有成人惡性腫瘤的3.79%,被認為是最致命的泌尿系統惡性腫瘤之一[2-3]。腎細胞癌除了具有異常的糖原代謝特征外,癌細胞中還會出現大量的脂質積累、侵襲和轉移現象[4-5],因此腎細胞癌在組織學上被定義為脂質積累和儲存的代謝疾病[6-7]。然而,腎細胞癌異常脂質代謝的分子機制和意義尚不清楚。此外,肥胖、糖尿病和動脈粥樣硬化也被認為是腎細胞癌的危險因素[8-10]。

近幾年,研究者們又把褐變這一觀念引入腫瘤“瘦身”方面,通過調控腫瘤細胞中脂質的褐變,使得腫瘤組織成為一個“自己燃燒自己”的“瘦身”狀態,達到抑制腫瘤生長、發展的作用[11]。大量研究證實,自噬的發生與癌癥息息相關。自噬途徑及其相關的通路被認為是治療癌癥的潛在干預靶點。鑒于腎細胞癌是以一種脂質積累和儲存的代謝疾病,本課題組把噬脂及脂質褐變與腎細胞癌的發生緊密連在一起。因此,本研究旨在闡明鳶尾素對腎細胞癌的影響及作用機制,探究噬脂與脂質褐變在鳶尾素影響腎細胞癌發展中的積極作用,通過一系列研究,可豐富對抗癌癥的作用機理,也為現階段新出現腫瘤“瘦身”概念及想法提供堅實的實驗基礎和理論依據,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞

實驗用人腎細胞腺癌細胞(ACHN)株購自武漢普諾賽生命科技有限公司(CL-0021)。

1.1.2試劑

β-Actin鼠多克隆抗體(TA-09)購自北京中杉金橋生物技術有限公司;PGC-1α兔單克隆抗體(ab106814)、UCP-1兔單克隆抗體(ab234430)均購自美國Abcam公司;逆轉錄試劑盒購自上海吐露港生物科技有限公司(22107);SYBR Green(FP201)購自天根生化科技(北京)有限公司;TRIzol試劑(15596026)購自美國Invitrogen公司;實時熒光定量逆轉錄PCR(qRT-PCR)引物、PGC-1α和UCP-1的敲除慢病毒及相應的控制載體均購自上海吉凱基因化學技術有限公司;胎牛血清購自美國Gbico公司;DMEM培養基購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1檢測鳶尾素對ACHN細胞存活率的影響

將ACHN均勻接種于96孔培養皿,分為6組,即對照組和鳶尾素20、50、100、200、400 nmol/L組,處理細胞48 h后,采用CCK-8測定細胞存活率。

1.2.2檢測鳶尾素對ACHN細胞噬脂、褐變、自噬及凋亡的影響

將ACHN均勻接種于培養皿,分為4組,即對照組和鳶尾素20、50、100 nmol/L組,處理細胞48 h后采用Western blot檢測PGC-1α和UCP-1蛋白表達情況;采用qRT-PCR測定Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、PGC-1α、UCP-1和PRDM16 mRNA表達情況;采用細胞自噬染色(MDC)檢測自噬小體情況;采用劃痕實驗檢測細胞修復愈合情況;采用油紅O染色檢測噬脂情況;流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.3qRT-PCR檢測mRNA表達情況

PCR擴增引物均有由上海吉凱生物有限公司合成,引物序列見表1,逆轉錄與qRT-PCR操作參照試劑盒說明書進行。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.4Western blot檢測相關蛋白表達情況

將不同處理組的細胞中加入細胞裂解液(RIPA裂解液∶PMSF為100∶1)置于冰上裂解15 min,之后測定蛋白濃度,根據定量結果進行制樣,將上樣緩沖溶液加入細胞裂解液中并煮沸10 min,隨后采用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠電泳分離,隨后濕轉到聚偏二氟乙烯膜上,濕轉完成后使用10%脫脂牛奶封閉2 h,加一抗4℃孵育過夜,TBST洗膜5遍,二抗常溫孵育2 h,TBST洗膜后用電化學發光法進行檢測。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

根據試劑盒說明書要求,把不同處理組的細胞上清液分為空白孔、標準孔、測定孔、對照孔,按步驟依次加入各種試劑,最后采用流式細胞儀測定。

1.2.6劃痕實驗檢測細胞愈合和修復情況

ACHN接種于6孔板中,待細胞生長融合至90%時,根據實驗目的在培養孔內加入不同濃度的藥物或聯合藥物處理48 h后,用200 μL滅菌槍頭在培養孔內劃痕,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后加入無血清培養基并置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h,倒置顯微鏡下觀察細胞愈合距離的變化檢測ACHN的細胞遷移情況。

1.2.7油紅O染色檢測噬脂情況

將處理好的細胞,用PBS溶液清洗2遍,加入新配制的10%多聚甲醛固定20 min,用PBS溶液清洗2遍,后加入油紅O染料,37 ℃恒溫箱染色30 min;用PBS清洗2遍,置于倒置顯微鏡下觀察其染色情況,拍照記錄。除此之外,還需用100%異丙醇洗脫細胞內的染料以進行定量,通過紫外分光光度計測量510 nm處的吸光度(A)值,記錄數據。

1.2.8檢測PGC-1α在鳶尾素抑制ACHN細胞生長中的關鍵作用

將ACHN均勻接種于培養皿,分為4組,即對照組、鳶尾素100 nmol/L組、鳶尾素100 nmol/L+sh-NC組、鳶尾素100 nmol/L+sh-PGC-1α組,處理細胞48 h后采用熒光顯微鏡觀察病毒感染情況;采用qRT-PCR測定PGC-1α、UCP-1和PRDM16 mRNA表達情況;流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.9檢測UCP-1在鳶尾素抑制ACHN細胞生長中的關鍵作用

將ACHN均勻接種于培養皿,分為4組,即對照組、鳶尾素100 nmol/L組、鳶尾素100 nmol/L+sh-NC組、鳶尾素100 nmol/L+sh-UCP-1組,處理細胞48 h后采用熒光顯微鏡觀察病毒感染情況;采用qRT-PCR測定PGC-1α、PRDM16和UCP-1基因mRNA表達情況;流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 鳶尾素對ACHN細胞存活率及褐變的影響

經過20、50和100 nmol/L鳶尾素處理48 h后,ACHN細胞存活率無明顯變化,差異無統計學意義(P>0.05)。當鳶尾素濃度增至200和400 nmol/L時,細胞存活率呈明顯降低趨勢,差異有統計學意義(P<0.05)。經鳶尾素處理48 h后,PGC-1α、UCP-1表達水平升高(P<0.05),且具有濃度依賴性,100 nmol/L鳶尾素處理后PGC-1α和UCP-1的表達增加最明顯,見圖1。

A:CCK-8試劑檢測鳶尾素處理細胞48 h后細胞的存活率;B:Western blot檢測棕色化相關蛋白的表達情況;C:qRT-PCR檢測棕色化相關基因mRNA表達情況;D:對Western blot結果進行定量分析;a:P<0.05,與對照組比較。

2.2 鳶尾素對ACHN細胞凋亡及遷移的影響

細胞凋亡結果顯示,鳶尾素能夠促進ACHN的細胞凋亡(P<0.05)。劃痕實驗顯示,鳶尾素抑制ACHN的細胞遷移(P<0.05),見圖2。

A:流式細胞術檢測鳶尾素處理后細胞凋亡情況;B:流式結果統計分析計算細胞凋亡率;C:鳶尾素處理細胞48 h后進行劃痕實驗,24 h后觀察細胞的遷移情況(50×);D:對劃痕實驗結果進行統計分析計算細胞遷移率;a:P<0.05,與對照組比較。

2.3 鳶尾素對ACHN細胞自噬及噬脂的影響

與對照組比較,鳶尾素的加入使得自噬相關Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ mRNA表達水平明顯升高(P<0.05),p62 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。油紅O染色結果顯示,鳶尾素在ACHN中以濃度依賴方式促進細胞噬脂,在100 nmol/L的鳶尾素中脂滴最少,噬脂最明顯(P<0.05),見圖3。

A:qRT-PCR檢測鳶尾素處理后自噬相關基因mRNA的表達情況;B:油紅O染色檢測鳶尾素處理對細胞脂滴聚集的影響(40×);C:酶標儀檢測A510值;a:P<0.05,與對照組比較。

2.4 PGC-1α在鳶尾素抑制ACHN細胞生長中的關鍵作用

PGC-1α會削弱鳶尾素對ACHN的影響,見圖4。

A:熒光觀察慢病毒sh-PGC-1α感染效果(100×);B:qRT-PCR檢測慢病毒sh-PGC-1α感染后棕色化相關基因mRNA表達情況;C:流式細胞術檢測慢病毒sh-PGC-1α感染對鳶尾素處理細胞后細胞凋亡的影響;D:對流式細胞術檢測結果進行統計分析計算細胞凋亡率;E:劃痕實驗檢測慢病毒sh-PGC-1α感染對鳶尾素處理細胞后的細胞遷移的影響(50×);F:對劃痕實驗結果進行統計分析計算細胞遷移率;a:P<0.05,與對照組比較;b:P<0.05,與鳶尾素100 nmol/L組比較。

2.5 UCP-1在鳶尾素抑制ACHN細胞生長中的關鍵作用

UCP-1制會削弱鳶尾素對ACHN的影響,見圖5。

3 討 論

腫瘤微環境中的癌細胞,在腫瘤發展過程中營養可得性不斷變化,常常利用脂質代謝來獲取能量、生物膜成分,以便于支持其快速增殖、存活、遷移、侵襲、轉移及對腫瘤微環境影響和癌癥治療的響應所需的信號分子[12-13],因此,脂質代謝異常成為癌癥中最明顯的代謝改變之一,不可忽視,現已證實脂質代謝異常與腎細胞癌、前列腺癌、子宮內膜癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、胃癌和直腸癌發展密切相關[14-17],腎細胞癌被定義為脂質積累和儲存的代謝性疾病,僅2018年全球就出現了40萬新病例和17.5萬死亡病例(全球癌癥觀測站)?，F已證實,異常的脂質積累和儲存為腎細胞癌的發展提供必不可少的提供能量支持。

正常情況下,米/褐色脂肪細胞屬于沉睡靜息狀態,但在特定的條件下如機體受到寒冷刺激[18]或運動時[8],白色脂肪細胞可以轉化為米/褐色脂肪細胞,這一過程被稱之為“褐變”,褐變過程中會伴隨著棕色化標記物(PGC-1α、UCP-1、PRDM16)的增加[19-21]。PGC-1α是能量代謝和脂質穩態的關鍵調節劑,與糖尿病和肥胖的代謝紊亂有關,有研究報道,與正常組織相比,腎細胞癌組織中PGC-1α表達降低,數據顯示患者預后不良與癌癥基因組圖譜(TCGA-KIRC)中PGC-1α表達降低有關,且PGC-1α在腎細胞癌中的下調與疾病進展密切相關[22]。UCP-1又名增溫素,能夠促進線粒體解耦聯氧化磷酸化,抑制細胞線粒體膜上三磷酸腺苷(ATP)的合成,促進機體產熱而不依賴ATP,以此增強生理狀態下機體的產熱反應。腫瘤“瘦身”是一種新的概念,即具有異常脂質的腫瘤細胞有效消耗脂質來抑制腫瘤的發展,而不產生額外的ATP[11]。有研究報道,PLCL1在腎細胞癌中下調,當恢復腎細胞癌細胞中PLCL1表達時通過增加UCP-1的泛素化可明顯抑制腫瘤進展,減少異常脂質積聚,因此PLCL1/UCP-1介導的脂質褐變對腎細胞癌細胞有促進“瘦身”并消耗異常的脂質堆積作用,從而抑制腎細胞癌的進展?，F已證實UCP-1介導的脂質褐變能夠促進腎癌細胞“瘦身”進而抑制腫瘤進展[23]。

自噬是指在饑餓和損傷等應激條件下細胞在雙層膜中形成自噬體,然后自噬體與溶酶體融合形成自溶體,降解內容物,為細胞生存提供能量的適應性過程[24]。已被證實自噬抑制了腎細胞癌的增殖[25],LncRNA SCAMP1通過miR-429調控ZEB1/JUN和自噬,促進氧化應激下兒童腎細胞癌的發生[26]。

2012年,科學家發現了一種新的肌肉因子——鳶尾素[27],它是由FNDC5裂解產物,經蛋白水解酶剪切后形成的多肽片段,由112個氨基酸殘基多肽片段組成,分子量為12×103,其氨基酸序列在大多數哺乳動物中高度保守,是一種與運動相關的、可調節糖脂代謝的新型肌肉因子,具有改善胰島素抵抗、促進白色脂肪棕色化、減輕體重等作用,是很具前景的代謝性疾病防治靶點。近些年研究證實鳶尾素主要在糖尿病、肥胖等代謝性疾病和癌癥方面發揮作用[28-30]。

本課題組試圖通過加入鳶尾素,探討其能否通過噬脂與脂質褐變消除異常脂質沉積,進而抑制ACHN細胞生長發展的目的。隨著鳶尾素濃度的增加,PGC-1α和UCP-1蛋白表達逐漸增加,表明鳶尾素引起PGC-1α和UCP-1蛋白表達變化呈現劑量依賴性;流式結果顯示,鳶尾素的濃度增加,腫瘤細胞的凋亡率逐漸升高;利用劃痕實驗來探討鳶尾素對腫瘤細胞遷移的影響,結果顯示鳶尾素可明顯抑制細胞遷移。此外,本研究進一步探討鳶尾素各濃度在引起自噬和噬脂中的影響,Western blot結果顯示,自噬相關Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ mRNA表達水平明顯降低,與此同時,p62 mRNA表達水平明顯升高,表明鳶尾素可促進細胞自噬。油紅O染色結果進一步佐證了鳶尾素可促進噬脂,減少細胞脂肪的異常沉積,這就有可能使得細胞“瘦身”增加腫瘤細胞凋亡。為了進一步探究PGC-1α和UCP-1在腫瘤細胞中的作用,構建PGC-1α和UCP-1慢病毒并將其轉染進細胞中,發現鳶尾素可增加腫瘤細胞凋亡并抑制細胞遷移,但下調PGC-1α和UCP-1的表達之后,上述作用被逆轉,證實PGC-1α和UCP-1在鳶尾素抑制ACHN進展中發揮的關鍵性作用。

綜上所述,鳶尾素能夠明顯抑制ACHN細胞遷移和增殖,且增加了ACHN細胞凋亡,這一作用的產生與激活噬脂和脂質褐變密切相關,其機制可能與下調PGC-1α和UCP-1蛋白在細胞的表達有關。本課題組通過探究鳶尾素對ACHN的影響及PGC-1α、UCP-1的關鍵性作用,為臨床的治療腎細胞癌提供了一定的理論依據和新的方向。但局限的是,目前只在細胞水平證明鳶尾素對腎細胞癌的影響,在動物水平是否有同樣的結果還需要進一步驗證。