lncRNA MIR100HG與肝細胞癌惡性生物學行為的相關性及其與hsa-miR-2355-3p調控關系的研究

王 霞

南京醫科大學附屬淮安第一醫院醫學檢驗中心,江蘇淮安 223300

肝細胞癌是最常見的惡性腫瘤之一,也是全球癌癥相關死亡的主要原因[1]。2020年,全球有近90.6萬人被診斷出患有肝癌,其中最常見的類型是肝細胞癌[2]。肝細胞癌是全球第三大癌癥死亡原因,其5年生存率約為18%[3]。因此,迫切需要探索和識別誘導腫瘤進展的關鍵分子,明確其機制。長鏈非編碼RNA(lncRNA)屬于長度超過200核苷酸的非編碼RNA,幾乎不具備蛋白質編碼的能力[4],lncRNA可以通過競爭性內源性RNA的方式調控微小RNA(miRNAs)表達。越來越多的證據表明,lncRNA在肝細胞癌發生發展過程中起到了重要作用[5]。例如,lncRNA X-非活性特異性轉錄物通過 miR-192/三聯基序蛋白 25促進乙型肝炎病毒相關肝細胞癌細胞的增殖和遷移[6]。有研究報道,miR-100-let-7a-2-miR-125b-1 宿主基因(MIR100HG)在結直腸癌、胃癌、三陰性乳腺癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中異常高表達,但是其在肝細胞癌中的表達和機制研究鮮有報道[7-11]。因此,本研究通過檢測lncRNA MIR100HG與hsa-miR-2355-3p在肝細胞癌組織中的表達并通過細胞實驗分析二者的調控關系,探討lncRNA MIR100HG對肝細胞癌發生、發展的影響?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2018年10月進行手術治療的肝細胞癌患者90例作為研究對象,研究對象按照腫瘤TNM分期分為TNM Ⅰ期59例、TNM Ⅱ期24例、TNM Ⅲ期2例、TNM Ⅳ期5例。納入標準:(1)完整的臨床病理參數、隨訪資料;(2)肝細胞癌患者進行根治性手術前未接受放射治療、化學治療及靶向治療。排除標準:(1)臨床病理參數和隨訪資料缺失;(2)復發后繼續選擇手術治療;(3)合并其他種類的腫瘤。每例患者取材腫瘤組織及對應的癌旁組織,癌旁組織距離肝細胞癌組織約5 cm以上。本研究使用4株肝細胞癌細胞系HepG2、MHCC97H、SK-HEP-1、SMMC-7721和1株人正常肝臟細胞系LO2,HepG2、MHCC97H由上海中科院細胞所提供,SK-HEP-1、SMMC-7721購自于美國ATCC細胞庫。

1.2儀器與試劑 上海芯超生物有限公司提供cDNA芯片,芯片編號:HLivH180Su16,上海吉凱生物有限公司提供敲減MIR100HG的3個干擾片段(si-MIR100HG);上海生工生物有限公司提供hsa-miR-2355-3p類似物/抑制物、lncRNA MIR100HG野生型、lncRNA MIR100HG突變型雙熒光素酶報告載體;美國賽默飛生物有限公司提供雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒。

1.3方法

1.3.1細胞培養 肝細胞癌細胞系SMMC-7721在RPMI 1640中培養(含有10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素),其余細胞系在DMEM中培養,所有培養皿均置于37 ℃、5%CO2的濕潤環境中培養。

1.3.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測lncRNA MIR100HG和hsa-miR-2355-3p相對表達水平 使用Trizol試劑盒(購自美國賽默飛生物有限公司)提取細胞株中的總RNA,隨后將其逆轉錄為互補DNA(cDNA),另外使用的cDNA芯片也是將組織抽提后的總RNA逆轉錄為cDNA后鋪于微陣列。使用qRT-PCR試劑盒(購自美國西格瑪生物有限公司)在ABI 7500熒光定量PCR儀上檢測lncRNA MIR100HG和hsa-miR-2355-3p相對表達水平。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為lncRNA MIR100HG的內參,U6為hsa-miR-2355-3p的內參,以2-ΔΔCt的形式表示相對表達水平,所用引物見表1。

1.3.3細胞遷移實驗及侵襲實驗 不同處理過的細胞在12孔板中進行培養,吸取細胞懸液加入Transwell上層小室中[侵襲實驗在遷移實驗基礎上多鋪一層基質膠(上層小室中),其余操作同遷移實驗],將含有10% 胎牛血清的培養液加入到下層小室;當細胞密度達到80%～90%時,將未通過篩孔的細胞用棉簽刮去,磷酸緩沖鹽溶液清洗掉受損的細胞,將通過篩孔的細胞使用4%多聚甲醛固定后在顯微鏡下拍照。

1.3.4細胞轉染和雙熒光素酶報告實驗 取對數生長期SMMC-7721細胞并用含10% 胎牛血清的DMEM制備成單細胞懸液,均勻地接種于6孔板中,放置于37 ℃、5%CO2的孵育箱中孵育,敲減lncRNA MIR100HG所用寡核苷酸序列見表1,選取3個siRNAs寡核苷酸中敲減效率最高的指標用于后續實驗。使用Starbase2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)及生物信息學數據庫驗證lncRNA MIR100HG與hsa-miR-2355-3p的潛在結合位點,將含有hsa-miR-2355-3p結合位點的lncRNA MIR100HG野生型和突變型克隆到pGL3質粒上,構建雙熒光素酶報告載體,使用lipofectamine 2000依據產品說明書將雙熒光素酶報告載體或陰性對照與hsa-miR-2355-3p類似物/抑制物共轉染至SMMC-7721細胞中,48 h后測定各組合熒光素酶活性,依據海腎螢光素酶活性將lncRNA MIR100HG標準化為相對表達水平。

2 結 果

2.1肝細胞癌組織中lncRNA MIR100HG相對表達水平與患者臨床病理參數的關系 肝細胞癌組織中lncRNA MIR100HG相對表達水平[4.251(3.260,5.302)]高于癌旁組織中lncRNA MIR100HG相對表達水平[0.044(0.039,1.037)],差異有統計學意義(Z=8.206,P<0.001)。肝細胞癌組織中hsa-miR-2355-3p相對表達水平[0.056(0.025,1.215)]低于癌旁組織中hsa-miR-2355-3p相對表達水平[3.120(2.100,4.293)],差異有統計學意義(Z=8.239,P<0.001)。肝細胞癌組織中lncRNA MIR100HG高表達組中腫瘤最大徑越大,更傾向于淋巴結轉移、血管侵犯、腫瘤遠處轉移;血清γ-谷氨酰基轉移酶(γ-GGT)水平越高,腫瘤TNM分期越高,更傾向于腫瘤復發(P<0.05)。因此,肝細胞癌組織中lncRNA MIR100HG相對表達水平與腫瘤最大徑、淋巴結轉移、血管侵犯、腫瘤遠處轉移,血清γ-GGT水平、腫瘤TNM分期及腫瘤復發有關,而肝細胞癌組織中lncRNA MIR100HG相對表達水平與患者性別、年齡、腫瘤數目、肝硬化狀況、肝硬化結節個數、腫瘤包膜、乙肝表面抗原狀態、血清甲胎蛋白(AFP) 、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)水平無關(P>0.05)。見表2。

2.2lncRNA MIR100HG相對表達水平與肝細胞癌患者預后的關系 將肝細胞癌患者根據TNMⅠ～Ⅳ期、TNMⅠ期、TNMⅡ期分別進行預后分析(由于TNM Ⅲ期和Ⅳ期患者分別只有2例和5例,樣本量太少,無法單獨進行分析),TNM Ⅰ～Ⅳ期、TNMⅠ 期、TNMⅡ 期肝細胞癌患者lncRNA MIR100HG高表達組總體生存率均低于低表達組,差異有統計學意義(χ2=52.06、27.99、11.13,P<0.05);TNM Ⅰ～Ⅳ期、TNMⅠ 期、TNMⅡ 期肝細胞癌患者lncRNA MIR100HG高表達組無復發生存率均低于低表達組,差異有統計學意義(χ2=91.60、60.72、21.59,P<0.05)。見圖1。經Cox比例風險模型探討影響肝細胞癌患者生存時間的獨立危險因素,發現有腫瘤遠處轉移、腫瘤TNM Ⅲ～Ⅳ期、有復發和lncRNA MIR100HG異常高表達(將90例肝細胞癌組織中lncRNA MIR100HG相對表達水平排序,高于或等于中位數則定義為lncRNA MIR100HG異常高表達)較之無腫瘤遠處轉移、TNM Ⅰ～Ⅱ期、無復發和lncRNA MIR100HG低表達對肝細胞癌患者的預后均產生不利的影響,差異有統計學意義(HR=11.156、6.462、8.585、7.799,P<0.05)。lncRNA MIR100HG異常高表達是肝細胞癌患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05)。見表3、4。

注:A、B分別評估90例TNM Ⅰ～Ⅳ期肝細胞癌患者lncRNA MIR100HG高表達組、低表達組總體生存率和無復發生存率;C、D分別評估59例TNMⅠ期肝細胞癌患者lncRNA MIR100HG高表達組、低表達組總體生存率和無復發生存率;E、F分別評估24例TNMⅡ期肝細胞癌患者lncRNA MIR100HG高表達組、低表達組總體生存率和無復發生存率。

表3 影響肝細胞癌患者生存時間的單因素回歸分析

表4 影響肝細胞癌患者生存時間的多因素回歸分析

2.3LncRNA MIR100HG在肝癌細胞中的表達及敲減效率的驗證 對4株肝細胞癌細胞系HepG2、MHCC97H、SK-HEP-1、SMMC-7721及人正常肝臟細胞系LO2中lncRNA MIR100HG相對表達水平進行檢測,結果發現4株肝細胞癌細胞系HepG2、MHCC97H、SK-HEP-1、SMMC-7721中lncRNA MIR100HG相對表達水平分別為(2.50±0.20)、(2.60±0.18)、(1.30±0.11)、(6.30±0.16),其中肝細胞癌細胞系HepG2、MHCC97H、SMMC-7721細胞lncRNA MIR100HG相對表達水平高于人正常肝臟細胞系LO2中lncRNA MIR100HG相對表達水平(1.00±0.16),差異有統計學意義(P<0.05);肝細胞癌細胞系SK-HEP-1與人正常肝臟細胞系LO2中lncRNA MIR100HG相對表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。選取肝細胞癌細胞系SMMC-7721轉染3個干擾片段(si-MIR100HG),陰性對照、si-MIR100HG-1#、si-MIR100HG-2#、si-MIR100HG-3#敲減后lncRNA MIR100HG相對表達水平分別為(1.00±0.16)、(0.76±0.05)、(0.60±0.05)、(0.07±0.02),其中si-MIR100HG-3#”敲減后lncRNA MIR100HG相對表達水平顯著下降(P<0.05)。

2.4LncRNA MIR100HG在肝細胞癌細胞中可能調控hsa-miR-2355-3p的表達 通過使用Starbase 2.0數據庫(http://starbase.sysu.edu.cn/),預測hsa-miR-2355-3p可能是lncRNA MIR100HG的下游靶標,預測結合位點見圖2A(處于11號染色體121962377-121962398位置)。肝細胞癌細胞系SMMC-7721中轉染si-MIR100HG干擾片段后hsa-miR-2355-3p的相對表達水平(7.62±0.26)與陰性對照(1.00±0.16)相比明顯升高(P<0.001)。此外,使用雙熒光素酶報告實驗進一步驗證lncRNA MIR100HG和hsa-miR-2355-3p之間的是否存在物理學上的結合位點,通過構建與hsa-miR-2355-3p具有結合位點的lncRNA MIR100HG野生型和突變型雙熒光素酶報告質粒。見圖2B?！癿icroRNA與lncRNA結合驗證”實驗結果顯示,與陰性對照相比,共轉染hsa-miR-2355-3p 類似物能夠抑制lncRNA MIR100HG野生型表達載體的熒光素酶活性[熒光素酶活性從(1.80±0.11)降為(0.7±0.09),差異有統計學意義(P<0.05)],但lncRNA MIR100HG突變型表達載體的熒光素酶活性沒有變化[熒光素酶活性從(1.90±0.12)降為(1.73±0.13),差異無統計學意義(P>0.05)],結果提示hsa-miR-2355-3p可能是lncRNA MIR100HG的下游靶標。

注:A表示通過Starbase2.0數據庫對lncRNA MIR100HG和hsa-miR-2355-3p進行序列比對;B表示雙熒光素酶報告質粒的構建,其中紅色堿基為對靶基因序列進行配對和突變的說明。

2.5下調hsa-miR-2355-3p逆轉敲減lncRNA MIR100HG介導的肝細胞癌細胞遷移和侵襲能力的抑制 Transwell實驗結果顯示,與陰性對照[細胞遷移實驗和侵襲實驗細胞計數分別為(101±7)個和(45±2)個]相比,轉染si-MIR100HG后[細胞遷移實驗和侵襲實驗細胞計數分別為(55±4)個和(11±1)個]能夠明顯抑制肝細胞癌細胞系SMMC-7721細胞遷移和侵襲能力(P<0.001)。聯合轉染si-MIR100HG和hsa-miR-2355-3p抑制物后發現,與單獨轉染si-MIR100HG相比[細胞遷移實驗和侵襲實驗細胞計數分別為(55±4)個和(11±1)個],聯合轉染后肝細胞癌細胞系SMMC-7721細胞遷移和侵襲能力得到恢復[細胞遷移實驗和侵襲實驗細胞計數分別為(100±6)個和(39±2)個],差異有統計學意義(P<0.001),單獨轉染hsa-miR-2355-3p抑制物后[細胞遷移實驗和侵襲實驗細胞計數分別為(121±6)個和(59±8)個]發現,與陰性對照[細胞遷移實驗和侵襲實驗細胞計數分別為(101±7)個和(45±2)個]相比,肝細胞癌細胞系SMMC-7721細胞遷移和侵襲能力明顯上調(P<0.05)。結果表明,敲減lncRNA MIR100HG抑制肝細胞癌細胞遷移和侵襲能力,下調hsa-miR-2355-3p可逆轉其抑制功能。見圖3。

圖3 轉染si-MIR100HG及聯合hsa-miR-2355-3p抑制物對肝細胞癌細胞系SMMC-7721細胞遷移和侵襲能力的影響(×100)

3 討 論

肝細胞癌是目前常見的高致死率的惡性腫瘤之一[12]。70%～80%患者明確診斷時已經處于晚期,只能接受姑息治療[13-14]。因此,闡明肝細胞癌進展的分子機制迫在眉睫。近期許多研究報道lncRNA與腫瘤的許多惡性生物學行為密切相關[15]。本研究結果顯示,lncRNA MIR100HG在肝細胞癌細胞系和腫瘤組織中異常高表達,推測其可能參與了腫瘤的發生。相關性分析證實,與lncRNA MIR100HG低表達組相比,lncRNA MIR100HG高表達組的腫瘤最大徑較大,血清γ-GGT水平較高,γ-GGT主要存在于肝內膽管上皮和肝細胞漿中,升高往往因為膽汁淤積造成,在阻塞性黃疸、原發性肝癌及酒精性肝病發生時升高尤為明顯[16-17],以上結果提示lncRNA MIR100HG可能具有促進肝細胞癌發生增殖的能力。肝細胞癌細胞發生轉移一般先侵襲基底膜,突破基底膜后侵犯血液系統和淋巴系統,進一步發生遠處轉移,腫瘤是否有侵襲性對預后影響很大[18]。本研究結果顯示,與lncRNA MIR100HG低表達組相比,lncRNA MIR100HG高表達組腫瘤細胞越傾向于淋巴結轉移和腫瘤遠處轉移;細胞遷移和侵襲實驗也證實lncRNA MIR100HG有促進肝細胞癌細胞遷移和侵襲的作用,但是需要進一步的體內動物實驗佐證。腫瘤TNM分期和復發與腫瘤進展密切相關,腫瘤TNM分期越高,患者預后往往不佳,治療后腫瘤復發往往會導致患者的生存期大幅縮短,對患者的預后產生十分不利的影響[19],相關性分析結果提示lncRNA MIR100HG與患者TNM分期及復發也有關,以上結果提示lncRNA MIR100HG異常高表達與肝細胞癌的發展密切相關。

將肝細胞癌患者根據TNM Ⅰ～Ⅳ期、Ⅰ期、Ⅱ期分別進行預后分析,結果顯示lncRNA MIR100HG高表達組的總體生存率和無復發生存率均明顯低于低表達組,同時多因素回歸分析也佐證肝細胞癌組織中lncRNA MIR100HG異常高表達是促進患者不良預后的獨立危險因素。提示lncRNA MIR100HG可以有效預測TNM Ⅰ和Ⅱ期肝細胞癌患者的預后,其lncRNA MIR100HG異常高表達提示肝細胞癌患者預后不良,由于TNM Ⅲ和Ⅳ期肝細胞癌患者例數太少,無法單獨進行統計分析,今后研究會進一步納入TNM Ⅲ期和Ⅳ期肝細胞癌患者進行預后分析。

miRNAs是一類約22個核苷酸大小的非編碼RNA,通過結合mRNA調控其表達[20]。本研究通過數據庫分析發現lncRNA MIR100HG與hsa-miR-2355-3p存在互補序列,hsa-miR-2355-3p在肝細胞癌組織中的表達顯著低于癌旁組織,且有研究報道hsa-miR-2355-3p與肺癌和胰腺癌的惡性生物學行為密切相關[21-22];在肝細胞癌細胞系SMMC-7721中敲減lncRNA MIR100HG后引起hsa-miR-2355-3p的上調,推測二者之間可能存在“此消彼長”的調控關系。通過進一步的Transwell實驗結果推斷lncRNA MIR100HG可能通過介導hsa-miR-2355-3p促進肝細胞癌細胞侵襲和遷移,此外,雙熒光素酶報告實驗初步推測lncRNA MIR100HG和hsa-miR-2355-3p二者可能存在物理學上的結合位點,但是需要進一步的確證實驗證實。

綜上所述,lncRNA MIR100HG異常高表達與肝細胞癌惡性生物學行為密切相關,參與了肝細胞癌的發生、發展,并且可能通過介導hsa-miR-2355-3p促進肝細胞癌細胞系遷移和侵襲,其有望成為肝細胞癌患者潛在的預后標志物及分子治療靶點。