基于直擴RT-PCR技術的寨卡病毒快速檢測方法的建立*

李 浪,古莉冰,朱 麗,何建安2,,葉 穎,張 然,李華文,李福緣,顧大勇2,△

1.廣東醫科大學公共衛生學院,廣東東莞 523808;2.深圳市檢驗檢疫科學研究院,廣東深圳 518033;3.中華人民共和國深圳海關,廣東深圳 518026;4.深圳國際旅行衛生保健中心/深圳海關口岸門診部,廣東深圳 518045;5.深圳市寶安區中醫院社區健康服務管理中心,廣東深圳 518133

寨卡病毒屬于黃病毒科,黃病毒屬,主要通過蚊媒傳播,其傳播媒介包括埃及伊蚊和白紋伊蚊等,蚊媒叮咬寨卡病毒感染者而被感染,其后再通過叮咬的方式將病毒傳染給其他人[1-2]。寨卡病毒還可以通過母嬰、性傳播和血液傳播[3-6]。我國在2016年2月開始有輸入病例報道,主要通過各出入境口岸傳入。隨著蚊媒活躍季節的到來,我國有伊蚊分布的地區存在本地傳播的風險。目前,寨卡病毒檢測主要運用聚合酶鏈反應(PCR)技術[7]。PCR現場快速檢測面臨的障礙之一是復雜的樣本前處理步驟,如能取消樣本預處理步驟,直接對樣本進行PCR或者實時熒光定量逆轉錄PCR(RT-PCR),將簡化實驗過程、節省時間,并有可能實現寨卡病毒疫情暴發現場的快速檢測與篩查,甚至實現自動化操作。目前國外已有關于樣本直擴PCR技術的研究,對于臨床樣本而言,研究最多的樣本是全血,而對其他樣本如尿、唾液等的研究還較少[8-11]。本研究通過采用特殊功能的聚合酶,建立直接對多種臨床樣本進行擴增檢測的方法,達到快速、便捷檢測出靶標的目的。

1 材料與方法

1.1標本來源 寨卡病毒假病毒委托漢恒生物有限公司包被合成,濃度為2×108PFU/mL;委托寶日醫生物技術(北京)有限公司合成10 μg 寨卡病毒 RNA干粉;委托生工生物(上海)有限公司合成5種蟲媒病毒[登革病毒(DENV)、黃熱病毒、基孔肯雅病毒(CHIKV)、西尼羅河病毒和乙型腦炎病毒]和5種細菌質粒(炭疽桿菌、布魯氏菌、鼻疽伯克霍爾德氏菌、類鼻疽伯克氏菌和土拉桿菌)及引物探針;所有樣本均來自深圳國際旅行衛生保健中心衛生檢疫中心實驗室。

1.2方法

1.2.1寨卡病毒靶序列及引物探針序列的設計 選擇寨卡病毒高度保守基因NS5片段作為靶標,以靶標為依據,應用美國國立生物信息技術中心(NCBI)的Primer-BLAST功能及美國應用生物系統公司(ABI)公司的PrimerExpress3.0.1軟件(PrimerPremier5),依據引物探針設計原則,設計滿足條件的引物及探針。寨卡病毒高度保守基因NS5的查詢覆蓋度為100%,表明幾乎blast基因庫中的所有寨卡病毒序列,E值為0表明結果非?？尚?序列一致性>99%表明該段序列在寨卡病毒中相似度很高,突變率低,高度保守。具體的引物、探針序列信息見表1。

表1 寨卡病毒高度保守基因NS5的引物、探針的序列信息

1.2.2DNA聚合酶的篩選 依據5種DNA聚合酶:高耐受性聚合酶(Omni Taq)、嗜熱細菌的耐熱DNA聚合酶(Tth)、 耐受特性的DNA聚合酶(Alpha Taq)、熱啟動DNA聚合酶(Hot Taq)、基于Tth酶改造的DNA聚合酶(TTX)的商家使用指南,初步建立反應體系與反應程序,對5種樣本(全血、血清、唾液、咽拭子和尿)進行檢測擴增。

1.2.3PCR增強劑的優選 向反應混合物中直接加6.25 μL 0.5×PCR增強劑-2(PEC-2)進行樣本檢測擴增;并分別向反應混合物中加入PCR增強劑,濃度為0.05%十二烷基硫酸鈉(SDS)、5%甘油、0.4 mg/mL牛血清白蛋白(BSA)、1∶10的明膠水溶液、2 mmol/L,二硫蘇糖醇(DTT)、10%二甲基亞砜(DMSO)和10%去離子甲酰胺,按PCR增強劑所需的濃度分別配成不含酶和引物探針的2.5×預混液,然后以1×預混液的量加入到反應混合物中對5種樣本進行檢測擴增。

1.2.4程序的優化 優化的逆轉錄溫度和退火/延伸溫度范圍分別為45～65 ℃和50～70 ℃,伯樂CFX96 Touch實時熒光定量PCR儀對設置的溫度范圍自動生成8個溫度梯度,對其中6個溫度(逆轉錄溫度:46.2、48.9、52.7、57.6、61.6、63.8 ℃;退火/延伸溫度:51.3、54.0、58.0、62.9、67.0、69.3 ℃)進行優化。所有優化實驗均以寨卡病毒假病毒的濃度為106PFU/mL的樣本為檢測對象,除了對全血樣本用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液進行稀釋后作為檢測對象外,其余4種樣本均直接用于檢測擴增。PCR反應體系的建立實驗在ABI 7500 實時熒光定量PCR儀上進行,逆轉錄溫度和退火/延伸溫度的優化實驗在伯樂CFX96 Touch實時熒光定量PCR儀上進行,每個實驗孔至少重復2次,每次實驗均包括1個陽性對照(RNA標準品)、無模板對照(NTC)及1個陰性對照,以最小閾值循環數(Ct)值和最大擴增效率為優化原則選擇最佳條件。結果分析條件設定:閾值設定原則,閾值線設定于剛好超過陰性對照擴增曲線的最高點。結果描述及判斷:陽性對照Ct值≤30并出現特定的擴增曲線,陰性對照無Ct值并且無特定擴增曲線,實驗結果成立;被檢樣本若羧基熒光素(FAM)熒光信號Ct值<40并出現特定的擴增曲線,則判斷為陽性;被檢樣本Ct值≥40時,則判定為陰性;對于某些未呈現S型曲線,但本底較高的樣本,應為陰性。

1.2.5檢測限、特異性實驗和重復性實驗 對5種樣本的系列梯度濃度(2×100～ 2×106PFU/mL)進行擴增,每個濃度設置3個重復孔,以能檢測到最低病毒滴度作為檢測限。以5種非寨卡病毒(屬于黃病毒科)質粒和5種細菌質粒為模板,進行特異性實驗。選擇其中3種樣本進行6次重復性實驗。

1.2.6方法的臨床應用 對8個寨卡病毒樣本、54個DENV樣本、8個CHIKV樣本和12陰性樣本即正常的臨床樣本進行擴增,以常規RT-PCR技術(以提取的核酸為模板)為金標準,計算臨床檢測靈敏度和特異度。其中8個寨卡病毒樣本包括患者1的血清樣本,患者2的血清樣本,患者3的咽拭子樣本,以及其他5個樣本。

1.2.8直擴RT-PCR技術 常規的RT-PCR需要以高質量的核酸為模板進行反應,如模板中有樣本抑制物或提取試劑組分殘留時就會抑制RT-PCR的順利進行。而直擴RT-PCR與其的主要區別在于,樣本可不經過核酸抽提,直接進行RT-PCR。直擴RT-PCR能夠節省時間,實現快速檢測。

2 結 果

2.1基于直擴RT-PCR技術的寨卡病毒快速檢測方法

2.1.1DNA聚合酶的篩選 5種DNA聚合酶對5種樣本的擴增曲線結果得知,Hot Start對5種樣本均未能擴增,只有Omin Taq對5種樣本均得到了不同程度的擴增。4種DNA聚合酶對5種樣本的擴增Ct值見圖1,Omni Taq和Alpha Taq對4種樣本(血清、唾液、咽拭子和尿)的擴增平均Ct值分別為16.40和16.79,Tth和TTX對這4種樣本的擴增平均Ct值分別為21.05和21.48,Omni Taq和Alpha Taq擴增平均Ct值明顯比Tth和TTX擴增平均Ct值小。基于Alpha Taq不能成功擴增全血樣本,DNA聚合酶選擇Omni Taq。

圖1 4種DNA聚合酶對5種樣本的擴增平均Ct值比較

2.1.2PCR增強劑的優化 7種PCR增強劑對基于直擴RT-PCR技術的寨卡病毒快速檢測5種樣本的擴增Ct值的影響見圖2。除了添加去離子甲酰胺、SDS對基于直擴RT-PCR技術的寨卡病毒快速檢測方法檢測5種樣本有明顯的抑制作用外(Ct值明顯比添加其他5種增強劑的Ct值高),添加其余5種PCR增強劑對基于直擴RT-PCR技術的寨卡病毒快速檢測方法檢測其他4種樣本(除了全血樣本)的擴增Ct值影響不大(Ct值波動范圍<1);添加甘油、BSA、明膠水溶液、DTT和DMSO有助于增強基于直擴RT-PCR技術的寨卡病毒快速檢測方法檢測全血樣本的擴增效率,其中添加明膠水溶液時Ct值最大相差2.18。基于5種樣本擴增效率及PCR反應體系已有成分的考慮,選擇不添加以上7種PCR增強劑。

圖2 7種PCR增強劑對基于直擴RT-PCR技術的寨卡病毒快速檢測方法檢測5種樣本的擴增Ct值影響

2.1.3反應程序的優化 在一系列梯度逆轉錄溫度下,基于直擴RT-PCR技術的寨卡病毒快速檢測方法檢測各樣本的擴增曲線和擴增產物電泳結果見圖3。從擴增曲線看出,不同逆轉錄溫度對血清、尿和咽拭子的Ct值影響不明顯(最大Ct值與最小Ct值相差<0.5),但是對唾液的Ct值有著明顯的影響;從圖3得知,在逆轉錄溫度為46.2、48.9、52.7、57.6、61.6、63.8 ℃下的Ct值分別是16.95、16.56、16.55、17.13、18.17和18.62,由此可知,在逆轉錄溫度46.2～52.7 ℃,Ct值變化較小,平均為16.69,從FAM熒光信號強度變化曲線可看出,在逆轉錄溫度46.2～52.7 ℃,FAM熒光強度較高,平均為2 675.2,而在逆轉錄溫度57.6～63.8 ℃,FAM熒光強度較低,平均為1 235.2,故逆轉錄溫度選取46.2～52.7 ℃的任何溫度達到的擴增效果相似。

注:A為不同逆轉錄溫度下各樣本的擴增曲線;B為擴增產物電泳結果。泳道1為NTC,泳道2～4和泳道5～7分別為尿和咽拭子在逆轉錄溫度為48.9、52.7和57.6 ℃條件下的產物電泳條帶;泳道8～10為血清在逆轉錄溫度為48.9、52.7 和57.6 ℃條件下的產物電泳條帶;泳道11～15為唾液在逆轉錄溫度為48.9、52.7、57.6、61.6和63.8 ℃條件下的產物電泳條帶;泳道16為DNA標準帶。

在一系列梯度退火溫度下采用直擴RT-PCR技術的寨卡病毒快速檢測方法檢測不同樣本擴增曲線和擴增產物電泳結果見圖4,由擴增曲線結果發現,退火溫度對擴增唾液、血清、咽拭子和尿的Ct值影響作用相似;從圖4可知,在退火溫度從67.0 ℃降至51.3 ℃的擴增Ct值和FAM熒光強度變化不顯著,但是從電泳結果發現,在較高退火溫度下,產生了較多的非特異性擴增產物,因此,在從67.0 ℃降至51.3 ℃盡量選擇較低退火溫度,故選擇51.0 ℃。

注:A為不同退火溫度下各樣本的擴增曲線;B為擴增產物電泳結果。泳道1、19為DNA標準帶;泳道2為NTC;泳道3～6和泳道7～10分別為尿和咽拭子在退火溫度為69.3、67.0、62.9和58.0 ℃條件下的產物電泳條帶;泳道11～14和泳道15～18分別為血清和唾液在退火溫度為69.3、67.0、62.9和58.0 ℃條件下的產物電泳條帶。

2.2直擴RT-PCR技術的效果驗證

2.2.1檢測限實驗 5種樣本的10倍梯度稀釋濃度的擴增曲線,咽拭子、血清、尿R2分別為0.999、0.994和0.998;擴增效率分別為102.15%、90.32%、96.02%,均在90%～110%;最低能檢測到的假病毒病毒滴度分別為血清103PFU/mL、尿、咽拭子和唾液102PFU/mL、全血104PFU/mL。見圖5。

圖5 直擴RT-PCR技術檢測5種樣本的靈敏度實驗擴增曲線

2.2.2特異性實驗 5種非寨卡病毒和5種細菌質粒的擴增結果見圖6,除了寨卡病毒 RNA有特異性擴增曲線,其他均未擴增。說明該方法與其他幾種病毒和細菌無交叉反應。

注:1為寨卡病毒 RNA;2為其他病毒和細菌質粒。

2.2.3重復性實驗 基于直擴RT-PCR的寨卡病毒快速檢測尿、全血和唾液樣本的重復性實驗的擴增曲線及重復性參數分別見圖7、表2。3種樣本的2個濃度重復6次的Ct值的變異系數百分比分別為1.33%和1.54%;1.03%和1.80%;1.07%和1.63%,均<5%。說明本研究建立的基于直擴RT-PCR的寨卡病毒快速檢測方法的重復性較好,可以保證不同樣本檢測結果的可靠性。

圖7 基于直擴RT-PCR的寨卡病毒快速檢測方法檢測3個樣本的重復性實驗的擴增曲線

表2 基于直擴RT-PCR技術的寨卡病毒快速檢測方法的重復性實驗

2.2.4方法的臨床應用 用本研究建立的直擴RT-PCR技術和常規RT-PCR技術對8個寨卡病毒樣本進行檢測,結果兩種方法的檢測結果一致(均只檢測到2個血清樣本)。同時利用直擴RT-PCR技術檢測非寨卡病毒感染的樣本,結果表明在對8個CHIKV樣本、54個DENV樣本及12個陰性樣本檢測時,均沒有發生擴增反應。見圖8、9。

注:A為本研究建立的直擴RT-PCR技術檢測各樣本,B為常規RT-PCR技術檢測各樣本;1為患者1血清、2為患者2血清、3為患者3咽拭子、4為其余5個樣本。

注:A表示檢測非寨卡病毒樣本的結果,B表示檢測正常臨床樣本的結果。

3 討 論

針對臨床上診斷生物材料而言,目前研究最多的是全血樣本。普遍認為全血中主要存在3種抑制物,即是紅細胞內的血紅蛋白和白細胞內的乳鐵蛋白及血漿中的免疫球蛋白G[12-15]。尿也是臨床上常用的檢測樣本,而且尿作為一種非侵入性樣本具有一定的檢測優勢。尿中主要存在的抑制物是尿素[16]。尿素的抑制作用與其濃度有關,濃度達到50 mmol/L時會產生完全抑制作用[17]。目前作用機制尚不清楚,但是大多數研究者認為尿素直接作用于聚合酶而導致聚合酶降解或阻礙引物退火而產生抑制作用。唾液中主要的抑制物可能是其所含的少量的蛋白或者其他物質,目前尚且不清楚[18]。

本研究結果發現,全血的直接擴增技術最難,其他4種樣本擴增較易且難度差不多。在只使用特殊DNA聚合酶時,5種樣本均被成功擴增,但是相比于其他4種樣本,全血樣本擴增的相對熒光強度較低,極大低于其他4種樣本的熒光強度。分析原因:考慮全血中存在嚴重影響其熒光收集的物質,對比全血樣本與其他樣本所含成分的差別,全血中含有獨特的細胞(紅細胞、白細胞)、血小板及一些蛋白,高溫會使細胞破裂,從而釋放出里面的血紅蛋白等成分,但是具體是哪種成分對熒光強度的吸收造成了影響,本研究中未來得及進一步研究;其次考慮血液中所含抑制成分多且濃度高,抑制作用因而較強,針對此原因,采用樣本稀釋的方法來提高擴增的熒光強度。結果表明隨著稀釋倍數的增加,熒光強度明顯逐漸增強,由此證明樣本的濃度確實會影響熒光強度的吸收。

聚合酶區是催化合成核酸的關鍵區域,該區域由手指區、掌心區和拇指區構成[19]。樣本直擴RT-PCR技術的可行性,在一定程度上取決于聚合酶的耐受特性。本研究結果顯示,用普通DNA聚合酶進行樣本直接RT-PCR擴增,其活性被完全抑制,然而,在未加任何PCR增強劑的情況下,使用耐抑制作用的DNA聚合酶能成功對未經過任何處理過的樣本進行一定程度的擴增。相比通過調節緩沖液成分來達到直擴目的,改用特殊的聚合酶,因不需要對反應體系進行過多優化而簡單易行,并且產生的增強效果也更加明顯,所以通過直接使用特殊的聚合酶來進行樣本的直接擴增更加具有優勢。

目前主要通過定點誘導突變、酶嵌合或酶組合等方式對酶進行改造來獲得高耐受的聚合酶。在本研究中優化的4種具有耐受特性的DNA聚合酶,其中Omni Taq和Alpha Taq均屬于聚合酶突變體,是Taq或Klentaq1聚合酶的三重突變,其中OmniTaq能在20%～25%全血存在下仍然保持一定活性,而Alpha Taq雖然具有耐受特性,但研究結果發現,不能耐受全血的抑制作用。Tth DNA聚合酶來源于Thermus thermophilus HB8的耐熱性DNA多聚酶,經大腸桿菌表達生成的重組型酶。TTX DNA聚合酶是一種比Taq DNA聚合酶更能對抗抑制劑影響的重組突變酶,與Tth相同,也具有逆轉錄活性,所以無論是DNA還是RNA,都可以高效率地進行擴增,但這兩種酶的耐受能力均低于Omni Taq和Alpha Taq,且均不耐受全血的抑制,推測原因可能是本身酶的耐受能力低,或者是該酶作為逆轉酶時被樣本抑制,導致逆轉錄活性不高,從而導致后續的PCR擴增受到影響。

本研究結果發現,不同PCR增強劑對不同樣本產生的效果不同,如加入SDS不僅沒有增強作用,反而抑制了對血清、唾液和咽拭子的擴增,已知SDS是一種非常高效的離子型表面活性劑,幾乎能溶解所有的蛋白質,因此在破壞病毒外殼促進核酸釋放的同時,可能也破壞了聚合酶的結構,從而使聚合酶失去活性。加入去離子甲酰胺,除了對唾液的擴增沒有明顯的影響外,對其余樣本的擴增均產生了明顯的抑制作用。除了SDS和去離子甲酰胺對不同樣本產生了明顯的不同效果外,其余5種PCR增強劑對樣本的擴增無明顯影響作用,這也表明,不是所有的PCR增強劑都能促進PCR擴增,加入的PCR增強劑會與現有體系中的反應成分進行相互作用,而產生抑制作用。

本研究建立的直擴RT-PCR技術的寨卡病毒快速檢測方法,可以直接從全血、血清、尿、唾液和咽拭子中檢測出寨卡病毒,該方法簡便快捷,靈敏度高,特異度強,為監測蟲媒病毒疫情及國內各出入境與口岸機關對病毒的檢驗檢疫提供了一種非常方便簡便快速的技術手段。