血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p與支氣管哮喘患兒氣道炎癥、重塑的關系及其預測價值分析*

張陸強,王麗雅,樊利春

1.海南醫學院兒科學院,海南?？?570206;2.?？谑袐D幼保健院感染與疾病控制科,海南海口 570000;3.海口市婦幼保健院兒科,海南?？?570000

支氣管哮喘是一種慢性呼吸道疾病,在兒童中較常見,近年來受遺傳因素及環境污染加重的影響,兒童患病率呈上升趨勢,該病主要特征為呼吸道高反應性,是由多種細胞與炎癥細胞介質引發[1-2]。支氣管哮喘的炎癥反應涉及多種活化細胞,其可促進炎癥因子水平上升[3-4]。炎癥反應引發的不可逆性氣道結構與功能變化,可演變為呼吸道結構性改變為氣道重塑,引起氣道高反應性與氣道阻塞,導致患兒出現喘息、胸悶、呼吸困難等癥狀[5]。盡管目前針對兒童支氣管哮喘的診治已取得較大進展,但整體治療水平仍欠佳[6]。故尋找與支氣管哮喘疾病進展相關的生物標志物以評估患兒病情及指導治療具有重要價值。相關研究顯示,氣道炎癥是支氣管哮喘發生、發展的關鍵機制,長鏈非編碼核糖核酸(lncRNA)與微小RNA(miRNA)等非編碼RNA均參與了氣道炎癥進展[7]。lncRNA ANRIL是一種新近發現的lncRNA,其已被證實可以調節心血管和炎性疾病中的炎癥反應,通過抑制核因子κB信號通路的激活提高氣道上皮細胞緊密連接蛋白表達,從而下調lncRNA ANRIL表達,減少細胞分泌炎癥因子[8-9]。miR-423-5p作為下游miRNA之一,在人類氣道上皮細胞中下調,且過表達miR-423-5p可以通過增強足細胞活力、抑制細胞凋亡和炎癥反應來拮抗高糖誘導的足細胞損傷[10]。本研究擬通過分析血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p與支氣管哮喘患兒氣道炎癥、重塑的關系及其預測價值,以期為支氣管哮喘防治提供更多參考。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取?？谑袐D幼保健院(簡稱本院)2020年6月至2022年12月收治的支氣管哮喘患兒98例作為研究對象,其中女47例,男51例;年齡為5～12歲,平均(8.40±1.42)歲;病程為2～7年,平均(5.52±0.63)年;病情嚴重程度:輕度47例、中度42例、重度9例。納入標準:(1)符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》中支氣管哮喘相關診斷標準[11];(2)無胸廓病變;(3)臨床資料完整且家屬知情同意;(4)無其他呼吸系統疾病。排除標準:(1)過敏性鼻炎等氣道內阻塞性疾病;(2)免疫性疾病、精神性疾病;(3)伴有心、肝、腎等重要臟器嚴重障礙;(4)先天性氣道或肺組織發育異常;(5)近3個月內使用糖皮質激素或有呼吸道感染史。根據文獻[11]中的哮喘分期標準將研究對象分為急性發作期患兒46例(發作期組);臨床緩解期患兒52例(緩解期組)。發作期組女22例,男24例;病程3～8年,平均(5.61±0.54)年,按病情嚴重程度分為輕度21例、中度22例、重度3例;年齡為5～11歲,平均(8.61±1.50)歲。緩解期組女25例,男27例;病程3～7年,平均(5.74±0.52)年,按病情嚴重程度分為輕度26例、中度20例、重度6例;年齡6～12歲,平均(8.22±1.36)歲。另選取同期于本院體檢健康的50例兒童作為健康組,其中女19例,男31例;年齡為4～12歲,平均(8.36±1.37)歲。各組年齡、性別比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究已獲本院醫學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1血清標本采集 急性發作期患兒入院后給予祛痰給氧、糾正水電解質紊亂等常規治療。采集支氣管哮喘患兒入院后第2天清晨空腹靜脈血3 mL,健康組在體檢時留血3 mL備用;以3 000 r/min速度離心15 min,離心半徑為10 cm,取上層血清置于試管內,放于-80 ℃冰箱中冷凍保存。

1.2.2血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p檢測 使用Trizol試劑盒(來于張家口賽諾生物科技有限公司)提取血清總RNA,用微量分光光度計[科納美(上海)科學儀器有限公司,型號F-320]驗證其純度與濃度,使用反轉錄試劑盒合成cDNA。以cDNA作為模板,按SYBR Premix Ex Taq試劑盒(來自上海赫果生物科技有限公司)行實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)擴增,反應條件為:95 ℃反應90 s、95 ℃反應30 s、62 ℃反應30 s、72 ℃反應15 s,共循環40次,收集其循環閾值。lncRNA ANRIL正向引物為5′-TGCTCTATCCGCCAATCAGG-3′,反向引物為5′-GGGCCTCAGTGGCACATACC-3′;miR-423-5p正向引物為5′-GCCCCCAGCGCCCAAC-3′,反向引物為5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′,內參U6的正向引物為5′-ATTGGAACGATACAGAG AAGATT-3′,反向引物為5′-GGAACGCTTCACG AATTTC-3′。采用2-ΔΔCt法計算lncRNA ANRIL、miR-423-5p相對表達量。

1.2.3炎癥因子檢測 采用酶聯免疫吸附試驗法檢測血清白細胞介素(IL)-13、轉化生長因子(TGF)-β1、血管內皮生長因子(VEGF)水平,試劑盒購自上海奧威生物科技有限公司,操作嚴格按說明書進行。

1.2.4氣道重塑指標測定 通過高分辨率胸部CT檢查,選擇主動脈弓、氣管分叉上下各1 cm、右肺下靜脈和橫隔頂上2 cm,于放大后的CT圖上用電子標尺測量氣道外直徑(D)、內直徑(L),連續測量3次取其平均值;支氣管厚度(T/D)為氣道外內外直徑差與外直徑比值,管壁面積/支氣管道總橫截面積(WA)為(D2-L2)/D2。

1.2.5肺功能檢測 采用肺功能檢測儀檢測患兒第一秒用力呼氣量(FEV1)、最高呼吸氣流(PEF)、最大呼氣中期流量(MMEF)指標,肺功能檢測儀由偉亞安醫療器械(上海)有限公司提供,型號 MasterScreen。

2 結 果

2.1各組血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p相對表達量比較 緩解期組與發作期組血清lncRNA ANRIL相對表達量高于健康組,血清miR-423-5p相對表達量低于健康組,差異有統計學意義(P<0.05);發作期組血清lncRNA ANRIL相對表達量高于緩解期組,血清miR-423-5p相對表達量低于緩解期組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p相對表達量比較

2.2各組血清炎癥因子指標比較 發作期組與緩解期組血清VEGF、IL-13、TGF-β1水平高于健康組,差異有統計學意義(P<0.05);發作期組血清VEGF、IL-13、TGF-β1水平高于緩解期組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清炎癥因子指標比較

2.3各組氣道重塑與肺功能指標比較 緩解期組與發作期組T/D、WA高于健康組,FEV1、PEF、MMEF水平低于健康組,差異有統計學意義(P<0.05);發作期組T/D、WA高于緩解期組,FEV1、PEF、MMEF水平低于緩解期組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組氣道重塑與肺功能指標比較

2.4血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p表達與氣道炎癥與重塑指標相關性分析 Pearson相關性分析結果顯示,血清lncRNA ANRIL表達與炎癥因子、氣道重塑指標呈正相關,與肺功能指標呈負相關(P<0.05);miR-423-5p表達與炎癥因子、氣道重塑指標呈負相關,與肺功能指標呈正相關(P<0.05)。見表4。

表4 血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p表達與氣道炎癥與重塑指標相關性分析

2.5血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p診斷支氣管哮喘的預測價值 ROC曲線分析顯示,血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p單獨及聯合檢測診斷支氣管哮喘的曲線下面積(AUC)及其95%CI分別為0.772(0.569～0.954)、0.707(0.451～0.965)、0.865(0.727～0.977),聯合檢測診斷支氣管哮喘的預測價值較高。見表5和圖1。

圖1 ROC曲線分析

表5 ROC曲線分析

3 討 論

支氣管哮喘患兒早期表現為短暫性呼吸困難、胸悶咳嗽等癥狀,若不能及時治療可發展為急性發作期,表現為癥狀突然且持續加重,目前支氣管哮喘只能通過藥物緩解或自行緩解,無法完全治愈[12]。支氣管哮喘主要為嗜酸性粒細胞浸潤,參與慢性氣道炎癥病變,該炎癥反應增加了氣道高反應性[13]。炎癥細胞因子在支氣管哮喘患兒氣道組織中發生浸潤、聚集、激活和釋放,且各炎癥細胞因子在氣道重塑中也發揮重要作用[14]。非編碼RNA是豐富的RNA分子,翻譯蛋白質的能力有限,人體內非編碼RNA的失衡與多種人類疾病的病理學有關[15]。lncRNA是一種長度超過200個核苷酸的非編碼RNA,不能編碼蛋白質,被認為是包括炎癥、血管生成和致癌在內的各種生物生理、病理過程的關鍵參與者[16]。miRNA是一種約22個核苷酸長的非編碼RNA小分子,作為信號分子可與信使RNA結合形成復合物,并調節下游信號通路[16]。

有研究顯示,lncRNA生長阻滯特異性轉錄異常對氣道平滑肌細胞與氣道上皮細胞炎癥產生影響,能促進支氣管哮喘等慢性氣道疾病發生發展[17]。lncRNA ANRIL因其在冠狀動脈疾病和尿酸腎病等炎癥性疾病中的遺傳意義而被熟知,其在肺部疾病發病機制中的作用通過促進非小細胞肺癌疾病進展而得到證明[18]。本研究結果顯示,緩解期組與發作期組血清lncRNA ANRIL相對表達量高于健康組,發作期組血清lncRNA ANRIL相對表達量高于緩解期組,差異有統計學意義(P<0.05)。lncRNA ANRIL可能通過促進淋巴細胞、嗜酸性粒細胞增長等過程釋放炎癥介質,由于急性發作期患者體內炎癥反應更重,因此lncRNA ANRIL表達上調。miRNA為非編碼RNA分子,經靶向結合mRNA抑制轉錄與轉錄后的翻譯過程,還參與多種病理生理過程,引起mRNA降解,并通過多信號通路參與哮喘等疾病氣道重塑過程[19]。本研究結果顯示,緩解期組與發作期組血清miR-423-5p相對表達量低于健康組,發作期組血清miR-423-5p相對表達量低于緩解期組,差異有統計學意義(P<0.05)。分析原因可能是miR-423-5p下調可引起缺氧導致心肌細胞凋亡、線粒體功能障礙等,急性期患者炎癥、免疫反應紊亂程度更高[20]。

IL-13能單獨介導哮喘發生,通過使嗜酸性粒細胞在體內聚集,增加黏液分泌而引起炎癥,于氣道重塑中發揮作用[21];TGF-β1可降低肺功能、增加氣道反應性等,可促進支氣管周圍膠原沉積并加重病情[22];VEGF在肺組織中廣泛分布,屬于促內皮細胞有絲分裂劑,對組織纖維化有誘導作用,對平滑肌細胞的基質金屬蛋白酶生成具有促進作用,進而增加細胞外基質以促進血管內皮細胞纖維增生[23]。本研究結果顯示,發作期組與緩解期組血清VEGF、IL-13、TGF-β1水平高于健康組,發作期組血清VEGF、IL-13、TGF-β1水平高于緩解期組,差異有統計學意義(P<0.05),說明炎癥因子指標在支氣管哮喘發病機制中發揮協同作用,降低以上炎癥因子水平能有效緩解患兒病情。本研究結果顯示,緩解期組與發作期組T/D、WA高于健康組,FEV1、PEF、MMEF水平低于健康組,差異有統計學意義(P<0.05);發作期組T/D、WA高于緩解期組,FEV1、PEF、MMEF水平低于緩解期組,差異有統計學意義(P<0.05),說明支氣管哮喘患兒存在不同程度氣道重塑與肺功能損傷,病情越嚴重,其氣道重塑和肺功能下降也越嚴重。

Pearson相關性分析結果顯示,血清lncRNA ANRIL表達與氣道炎癥、重塑指標呈正相關,與肺功能指標呈負相關;miR-423-5p表達與氣道炎癥、重塑指標呈負相關,與肺功能指標呈正相關。提示血清lncRNA ANRIL可能通過上調炎癥因子表達以促進支氣管哮喘患兒氣道重塑并導致肺功能損傷;miR-423-5p是參與調控血管形成、炎癥反應等過程的miRNA,對炎癥反應具有抑制作用,miR-423-5p表達下調可促進機體炎癥形成,加重病情[24]。ROC曲線分析顯示,lncRNA ANRIL、miR-423-5p單獨及聯合檢測的AUC分別為0.772、0.707、0.865,其中聯合檢測的診斷價值較高,說明血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p聯合檢測診斷支氣管哮喘具有較好的預測價值,分析原因為血清lncRNA ANRIL、miR-423-5p診斷支氣管哮喘的預測互為補充,發揮協同作用以提高診斷支氣管哮喘的預測效能。

綜上所述,支氣管哮喘患兒血清lncRNA ANRIL相對表達量上升、miR-423-5p相對表達量下降,與氣道肺功能、炎癥因子及氣道重塑指標密切相關,聯合檢測診斷支氣管哮喘的預測效能較高。