非小細胞肺癌組織中lncRNA GAS5、LHPP表達與上皮間質化相關性及臨床意義*

陳麗萍,籍 強,陳艷紅,史永興,馮 平,林衛佳,項保利,趙建清

河北北方學院附屬第一醫院:1.呼吸與危重癥醫學科;2.胸心血管外科;3.病案管理科,河北張家口 075000

非小細胞肺癌(NSCLC)占所有原發性支氣管肺癌85.00%以上,是肺癌最常見類型,據國際癌癥研究機構報道,2020年我國肺癌新發病例815 563例,占全球肺癌新發病例的36.96%,死亡714 699例[1]。因此針對NSCLC患者預后評估是當前研究熱點。實驗證實,上皮間質轉化(EMT)在NSCLC發生、發展中起著重要作用[2]。尋找EMT相關影響因素有利于NSCLC患者預后評估。研究表明,長鏈非編碼核糖核酸(LncRNA)能通過調控EMT等機制參與NSCLC發生、發展[3]。生長抑制特異性基因5(GAS5)是新近發現的一種LncRNA,與乳腺癌EMT和膠質瘤患者預后有關[4-5]。磷酸賴氨酸磷酸組氨酸無機焦磷酸鹽磷酸酶(LHPP)是一種組氨酸磷酸酶,能通過調控多種蛋白磷酸化和信號通路參與腫瘤EMT和細胞惡性進展[6]。基于此,本研究擬探討NSCLC組織中lncRNA GAS5、LHPP表達與EMT相關性及臨床意義,旨在為改善NSCLC患者預后提供更多思路。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年6月至2020年1月在河北北方學院附屬第一醫院行手術切除的NSCLC 90例患者的癌組織及距離癌組織大于3 cm的癌旁組織。NSCLC 90例患者中女31例、男59例,年齡25～74歲,平均(60.54±7.65)歲,47例吸煙、53例有淋巴結轉移。NSCLC 90例患者病理類型:25例腺癌、54例鱗癌、11例腺鱗癌;腫瘤最大徑:≥3 cm者57例、<3 cm者33例;分化程度:33例低分化、57例中高分化;腫瘤TNM分期[7]:46例Ⅰ～Ⅱ期、44例Ⅲ期。納入標準:(1)NSCLC經病理檢查確診;(2)年齡≥18歲;(3)接受根治性或姑息性切除;排除標準:(1)合并精神疾病;(2)合并其他部位惡性腫瘤;(3)非初診患者;(4)合并其他肺部疾病;(5)入院前已接受抗腫瘤治療;(6)合并急慢性感染;(7)不可手術切除或術前接受化療;(8)合并自身免疫性疾病;(9)不能耐受手術。本研究經醫院倫理委員會批準(倫理編號:K2020298),患者或家屬簽署同意書。

1.2方法 NSCLC患者癌組織和癌旁組織使用總RNA提取試劑盒(廣州威佳科技有限公司,貨號:R0016)提取總RNA,紫外分光光度計鑒定RNA純度和完整性合格后[吸光度(A)260/A280為1.8～2.0],通過逆轉錄酶試劑盒(北京祥生興業科技有限公司,貨號:RR001B)將RNA逆轉錄為cRNA。按照聚合酶鏈反應試劑盒(上海翌圣生物科技股份有限公司,貨號:10102ES03)說明書,使用實時熒光定量聚合酶鏈反應系統進行擴增。反應總體積共20 μL,其中cRNA模板1 μL、2×Hieff?PCR Master Mix 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、去離子水7 μL;循環參數:95 ℃預變性5 min 1次,94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s 35次,終延伸72 ℃ 10 min。基因引物序列見表1,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內參,2-ΔΔCt法計算NSCLC患者癌組織和癌旁組織中lncRNA GAS5、LHPP和EMT相關蛋白[E-鈣黏蛋白(E-Cad)、N-鈣黏蛋白(N-Cad)和波形蛋白(VIM)]的相對表達量。

表1 基因引物序列

1.3預后分組 NSCLC患者術后通過電話或門診方式隨訪3年(每次3～6個月),統計3年總生存率,隨訪終止事件為患者死亡或2023年1月。根據NSCLC患者癌組織中lncRNA GAS5、LHPP mRNA表達均值分為高表達組、低表達組。

2 結 果

2.1NSCLC患者癌組織和癌旁組織中lncRNA GAS5、LHPP mRNA和EMT相關蛋白表達比較 NSCLC患者癌組織中lncRNA GAS5、LHPP mRNA、E-Cad mRNA表達低于癌旁組織,N-Cad mRNA、VIM mRNA表達高于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖1。

注:A為NSCLC組織和癌旁組織中lncRNA GAS5表達比較;B為NSCLC組織和癌旁組織中LHPP mRNA表達比較;C為NSCLC組織和癌旁組織中E-Cad mRNA表達比較;D為NSCLC組織和癌旁組織中N-Cad mRNA表達比較;E為NSCLC組織和癌旁組織中VIM mRNA表達比較。

表2 NSCLC患者癌組織和癌旁組織中lncRNA GAS5、LHPP mRNA和EMT相關蛋白表達比較

2.2NSCLC患者癌組織中lncRNA GAS5、LHPP mRNA與EMT相關蛋白表達的相關性 Pearson相關性分析顯示,NSCLC患者癌組織中lncRNA GAS5與E-Cad mRNA表達呈正相關(r=0.724,P<0.001),與N-Cad mRNA、VIM mRNA表達呈負相關(r=-0.699、-0.689,P<0.001);LHPP mRNA與E-Cad mRNA表達呈正相關(r=0.751,P<0.001),與N-Cad mRNA、VIM mRNA表達呈負相關(r=-0.718、-0.731,P<0.001);lncRNA GAS5與LHPP mRNA表達呈正相關(r=0.651,P<0.001)。見圖2。

圖2 NSCLC患者癌組織中lncRNA GAS5、LHPP mRNA與EMT相關蛋白表達的相關性分析

2.3lncRNA GAS5、LHPP mRNA表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系 不同分化程度、腫瘤TNM分期、淋巴結轉移的NSCLC患者癌組織中lncRNA GAS5、LHPP mRNA表達比較,差異有統計學意義(P<0.05);不同性別、年齡、吸煙、病理類型、腫瘤最大徑的NSCLC患者癌組織中lncRNA GAS5、LHPP mRNA表達比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 lncRNA GAS5、LHPP mRNA表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系

2.4lncRNA GAS5、LHPP mRNA表達與NSCLC患者3年總生存率的關系 隨訪3年,90例NSCLC患者失訪4例,死亡43例,3年總生存率為52.22%(47/90)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,lncRNA GAS5高表達組(lncRNA GAS5≥1.32,44例)的3年總生存率[68.18%(30/44)]高于lncRNA GAS5低表達組(lncRNA GAS5<1.32,46例)的3年總生存率[36.96%(17/46)];LHPP mRNA高表達組(LHPP mRNA≥1.12,46例)的3年總生存率[67.39%(31/46)]高于LHPP mRNA低表達組(LHPP mRNA<1.12,44例)的3年總生存率[36.36%(16/44)],差異有統計學意義(χ2=10.274、10.322,P<0.05)。見圖3。

圖3 不同lncRNA GAS5、LHPP mRNA表達的NSCLC患者Kaplan-Meier生存曲線

2.5NSCLC患者預后的單因素和多因素Cox回歸分析 將3例失訪患者排除,以性別、年齡、吸煙、病理類型、腫瘤最大徑、分化程度、腫瘤TNM分期、淋巴結轉移、lncRNA GAS5、LHPP mRNA為自變量,隨訪時間為時間變量,生存狀態(死亡/存活=1/0)為因變量,建立NSCLC患者預后的Cox回歸模型。結果顯示:低分化、腫瘤TNM分期Ⅲ期、有淋巴結轉移為NSCLC患者死亡的獨立危險因素,lncRNA GAS5≥1.32、LHPP mRNA≥1.12為獨立保護因素(P<0.05)。見表4。

表4 NSCLC患者預后的單因素和多因素Cox回歸分析

3 討 論

NSCLC是全球癌癥相關死亡的主要原因,隨著我國居民健康素養水平的穩步提升和低劑量螺旋CT篩查的開展,我國NSCLC高危人群篩查、管理和早期診斷取得較大進展,但仍有75%的患者在初次診斷時處于晚期階段[8-11]。EMT是指上皮細胞通過特定程序轉化為間質表型細胞的過程,為胚胎正常發育所必需的過程,但在NSCLC細胞中EMT異常激活會增強其侵襲和轉移能力,促進NSCLC細胞向周圍或其他組織侵襲、轉移,以促進NSCLC細胞增殖、侵襲、轉移、存活和耐藥等惡性進展[12]。研究NSCLC患者EMT和預后相關影響因素,對指導其個體化治療和預后評估具有重要的意義。

E-Cad和N-Cad作為上皮細胞間連接的重要蛋白,前者能抑制上皮細胞運動性抑制其向間質表型轉化,以保持上皮細胞結構穩態而抑制EMT,后者能促進細胞-細胞間黏附進而促進EMT;VIM作為中間絲蛋白能增強細胞強度、韌性、彈性、拉伸性促進EMT[13]。本研究結果顯示,NSCLC患者癌組織中E-Cad mRNA表達降低,N-Cad mRNA、VIM mRNA表達升高,說明NSCLC存在明顯的EMT,符合其進展機制。NSCLC是多種因素參與的復雜過程,表觀遺傳改變通過影響多種機制參與NSCLC過程[14]。LncRNA是一類新興表觀遺傳改變調控分子,能通過海綿吸附微小RNA,競爭性干擾其與mRNA結合或直接與蛋白質相互作用參與NSCLC進程[3]。lncRNA GAS5是位于人染色體1q25.1上的一種lncRNA,最初研究發現lncRNA GAS5過表達時能誘導T細胞周期阻滯和凋亡,而低表達時能促進T細胞周期進展和生長,近年有研究發現lncRNA GAS5也對其他多種細胞具有生長抑制作用[15]。有研究報道,lncRNA GAS5能靶向miR-26a抑制蛋白酪氨酸激酶1/信號轉導和轉錄活化因子3信號通路抑制子宮內膜樣癌細胞侵襲和凋亡;lncRNA GAS5能靶向miR-424抑制宮頸癌增殖[16-17]。這些研究提示,lncRNA GAS5在惡性腫瘤中發揮抑制作用。有研究報道,lncRNA GAS5低表達與卵巢癌預后不良有關[18]。有研究指出,lncRNA GAS5低表達與NSCLC細胞周期進展和生長有關[19]。本研究結果顯示,NSCLC患者癌組織中lncRNA GAS5表達低于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.05),不同分化程度、腫瘤TNM分期、淋巴結轉移的NSCLC患者癌組織中lncRNA GAS5表達比較差異有統計學意義(P<0.05),lncRNA GAS5≥1.32為獨立保護因素(P<0.05),進一步說明lncRNA GAS5參與NSCLC發生、發展。分析原因可能是lncRNA GAS5高表達能靶向miR-205上調磷酸酶和張力蛋白同系物,抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路激活,進而抑制NSCLC細胞增殖、分化、遷移、侵襲和存活,進而提高患者預后[20]。

組氨酸磷酸酶是一類具有磷酸化或去磷酸化的酶,其異常障礙可導致細胞信號傳導通路和蛋白表達異常,與腫瘤發生發展密切相關[21]。LHPP是新近被證實的一種組氨酸磷酸酶,位于人染色體10q26.13處,能與組氨酸磷酸酶共同發揮磷酸化和去磷酸化作用,LHPP缺失將導致磷酸化與去磷酸化失衡,進而激活Wnt/β-連環蛋白、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B等信號通路,促進腫瘤發生發展[22]。已有研究報道,LHPP低表達與肝癌、腦膠質瘤、腎癌、前列腺癌、結直腸癌等惡性腫瘤進展有關,提示LHPP是種抑癌基因[22]。有研究報道,LHPP低表達與胃癌、鼻咽癌患者預后不良有關[23-24]。有研究指出,LHPP低表達與NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲有關[25]。本研究結果顯示,NSCLC患者癌組織中LHPP mRNA表達低于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.05),LHPP mRNA高表達組的3年總生存率高于LHPP mRNA低表達組的3年總生存率,LHPP mRNA≥1.12為獨立保護因素(P<0.05),進一步也說明LHPP參與NSCLC發生、發展。分析原因可能是LHPP高表達能抑制Wnt/β-連環蛋白、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B等信號通路激活,抑制NSCLC細胞增殖、分化、遷移、侵襲和促進凋亡,進而促進患者預后改善[22]。

有研究報道,lncRNA GAS5與乳腺癌細胞EMT有關,LHPP與肝細胞癌細胞EMT有關[26-27]。本研究結果顯示,NSCLC患者癌組織中lncRNA GAS5與E-Cad mRNA表達呈正相關(r=0.724,P<0.001),與N-Cad mRNA、VIM mRNA表達呈負相關(r=-0.699、-0.689,P<0.001),提示lncRNA GAS5、LHPP mRNA表達升高可能通過EMT促進NSCLC細胞惡性進展。有研究報道,上調lncRNA GAS5、LHPP能通過抑制EMT以抑制NSCLC細胞惡性進展[19,25]。此外本研究結果顯示,lncRNA GAS5與LHPP mRNA表達呈正相關(r=0.651,P<0.001),提示lncRNA GAS5和LHPP可能共同通過EMT參與NSCLC發生、發展。最近YANG等[25]通過雙熒光素酶報告基因檢測也發現,上調lncRNA GAS5能靶向miR-217上調LHPP表達,進而抑制NSCLC細胞EMT、遷移和侵襲。但本研究結果還需多中心研究驗證,關于lncRNA GAS5、LHPP參與NSCLC的機制也有待進一步實驗發現。

綜上所述,NSCLC患者癌組織中lncRNA GAS5、LHPP mRNA低表達,與EMT相關蛋白表達、分化程度、腫瘤TNM分期、淋巴結轉移和預后有關,可能成為NSCLC診治的新靶點。