子宮內膜癌組織miR-141-3p、miR-149-3p表達與增殖基因、臨床病理特征和預后的關系*

王 江,李 艷,賀泓霓,伍 燕

南充市中心醫院/川北醫學院第二臨床醫學院婦科,四川南充 637000

子宮內膜癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤,全球每年子宮內膜癌新發病例達32萬人,死亡例數達7.6萬人[1]。子宮內膜癌的治療包括手術治療、放化療等,但仍有15%～20%治療后出現腫瘤復發和轉移,復發后5年生存率低于20%[2]。微小核糖核酸(miRNA)參與細胞增殖分化、代謝、衰老及血管生成等過程[3]。miRNA的表達異常與惡性腫瘤的發生發展密切相關,是潛在的腫瘤標志物[4]。miR-141-3p是一種具有腫瘤促進作用的miRNA,研究表明,直腸癌中miR-141-3p的表達上調能夠通過抑制抑癌基因B淋巴細胞瘤-2的表達,促進腫瘤細胞的增殖,并抑制腫瘤細胞凋亡[5]。miR-149-3p也是近年來發現的具有腫瘤促進作用的新的miRNA,研究發現,卵巢癌中miR-149-3p表達上調能夠通過靶向抑制基質金屬蛋白酶組織抑制劑-2,促進腫瘤細胞上皮間質轉化,導致腫瘤侵襲和轉移能力增強[6]。細胞獲得無限增殖潛能是惡性腫瘤的基本特征,子宮內膜癌的發生、發展中涉及增殖基因[增殖細胞核抗原(PCNA)、細胞周期素D1(cyclin D1)、細胞周期蛋白依賴激酶4(CDK4)]mRNA的過度表達[7-8]。本研究通過檢測子宮內膜癌患者癌組織中miR-141-3p、miR-149-3p表達,分析其與增殖基因、臨床病理特征和預后的關系,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年2月至2019年2月本院診治的98例子宮內膜癌患者作為研究對象,年齡34～79歲,平均(62.54±6.71)歲。研究對象按照國際婦產科聯盟(FIGO)分期標準[9]分為Ⅰ～Ⅱ期61例,Ⅲ期37例;腫瘤分化程度:高分化27例,中分化30例,低分化41例;絕經史:有絕經史64例、無絕經史34例;有無淋巴結轉移:無淋巴結轉移76例、有淋巴結轉移22例。納入標準:(1)經術后組織病理學檢查明確為子宮內膜癌;(2)初次診治;(3)患者能夠配合相關檢查治療及隨訪。排除標準:(1)近3個月接受激素或化療治療;(2)合并其他惡性腫瘤;(3)合并類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病;(4)臨床病理及隨訪資料不完整。本研究經本院醫學倫理委員會批準通過,患者或家屬對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR檢測癌組織和癌旁組織miR-141-3p、miR-149-3p及增殖基因表達 留取術中獲取的子宮內膜癌患者癌組織和癌旁組織(距離癌組織2 cm),液氮研磨后離心取上清,采用Trizol法提取組織中總RNA,微量分光光度計(美國賽默飛公司,型號Narodrop 1000)檢測組織總RNA純度,A260/A280比值=1.8～2.1。將總RNA逆轉錄為cDNA,然后進行實時熒光定量PCR。一步法逆轉錄試劑盒和2×SYBR Green PCR Master mix試劑盒購自北京索萊寶公司,貨號T2240,SR1110。總體系10.0 μL,包括2×SYBR Green 5.0 μL,cDNA 1.0 μL,正反向引物各0.5 μL,雙蒸水3.0 μL。實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司,型號ABI 7500。miR-141-3p、miR-149-3p反應條件:95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,70 ℃延伸30 s,變性退火延伸共40次循環。PCNA mRNA、cyclin D1 mRNA、CDK4 mRNA反應條件:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸30 s,變性退火延伸共40次循環。miR-141-3p、miR-149-3p以U6為內參,PCNA mRNA、cyclin D1 mRNA、CDK4 mRNA以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參,根據2-△△Ct法計算miR-141-3p、miR-149-3p、PCNA mRNA、cyclin D1 mRNA、CDK4 mRNA的相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2隨訪 所有患者以電話和門診復查為主進行隨訪,隨訪內容為生存情況,隨訪截止至2022年3月1日。隨訪終點為隨訪時間結束或患者死亡。記錄患者生存時間,計算3年總體生存率,即自病理確診日至患者死亡日或隨訪結束。

2 結 果

2.1子宮內膜癌患者癌組織和癌旁組織中miR-141-3p、miR-149-3p及增殖基因表達比較 子宮內膜癌患者癌組織中miR-141-3p、miR-149-3p、PCNA mRNA、cyclinD1 mRNA、CDK4 mRNA相對表達水平高于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 子宮內膜癌患者癌組織和癌旁組織中miR-141-3p、miR-149-3p及增殖基因表達比較

2.2子宮內膜癌患者癌組織中miR-141-3p、miR-149-3p表達與增殖基因的相關性 子宮內膜癌患者癌組織中miR-141-3p、miR-149-3p表達與PCNA mRNA、cyclinD1 mRNA、CDK4 mRNA表達呈正相關(均P<0.05)。見表3。

表3 miR-141-3p、miR-149-3p表達與增殖基因的相關性

2.3不同臨床病理特征的子宮內膜癌患者癌組織miR-141-3p、miR-149-3p表達比較 FIGO分期Ⅲ期、有淋巴結轉移的子宮內膜癌患者癌組織miR-141-3p、miR-149-3p相對表達水平分別高于FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移的子宮內膜癌患者,差異有統計學意義(P<0.05)。不同年齡、腫瘤分化程度、絕經史的子宮內膜癌患者血清miR-141-3p、miR-149-3p相對表達水平比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 miR-141-3p、miR-149-3p表達與臨床病理特征的關系

2.4miR-141-3p、miR-149-3p表達與子宮內膜癌臨床預后的關系 根據miR-141-3p、miR-149-3p相對表達水平的中位數2.10,2.03為臨界值,分別分為miR-141-3p高表達組(n=48)和miR-141-3p低表達組(n=50),miR-149-3p高表達組(n=47)和miR-149-3p低表達組(n=51)。子宮內膜癌患者隨訪過程中,無失訪,死亡15例,3年總體生存率為84.69%(83/98)。miR-141-3p高表達組和miR-141-3p低表達組患者3年總體生存率分別為75.00%(36/48)、94.00%(47/50)。miR-141-3p高表達組3年總體生存率顯著低于miR-141-3p低表達組,差異有統計學意義(Log-rankχ2=7.043,P=0.008)。miR-149-3p高表達組和miR-149-3p低表達組患者3年總體生存率分別為74.47%(35/47)、94.12%(48/51),miR-149-3p高表達組患者3年總體生存率顯著低于miR-149-3p低表達組,差異有統計學意義(Log-rankχ2=7.094,P=0.007)。見圖1。

圖1 Kaplan-Meier曲線分析miR-141-3p、miR-149-3p對子宮內膜癌患者預后的影響

2.5影響子宮內膜癌患者預后的因素分析 以子宮內膜癌患者預后為因變量(1=死亡,0=存活,t=生存時間),以年齡(>60歲vs.≤60歲)、絕經史(有vs.無)、腫瘤分化程度(低分化vs.高中分化)、FIGO分期(Ⅲ期vs.Ⅰ～Ⅱ期)、淋巴結轉移(有vs.無)、miR-141-3p、miR-149-3p為自變量,進行單因素Cox回歸分析,將單因素分析中差異有統計學意義的因素(P<0.05)納入多因素Cox回歸分析,結果FIGO分期Ⅲ期、有淋巴結轉移、miR-141-3p升高、miR-149-3p升高是影響子宮內膜癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。見表5、6。

表5 單因素Cox回歸分析影響子宮內膜癌患者預后的因素

表6 多因素Cox回歸分析影響子宮內膜癌患者預后的因素

3 討 論

子宮內膜癌是我國女性常見的惡性腫瘤,目前子宮內膜癌的治療以手術、放化療等治療為主,早期患者臨床預后較好,但對于晚期或復發患者,遠期生存預后較差[10]。子宮內膜癌的疾病機制尚不清楚,其發生與雌激素暴露、代謝異常及遺傳易感性等因素有關[11-12]。因此,深入研究子宮內膜癌的病因及機制,尋找影響子宮內膜癌進展及預后的標志物,對子宮內膜癌的臨床診治及改善患者生存預后,具有重要意義。

子宮內膜癌中增殖基因表達異常涉及原癌基因過度激活、轉錄后調控異常等多種機制[13-14]。miR-141-3p基因位于12p13.31,其能夠通過靶向結合靶基因mRNA的3′非編碼區,參與細胞分化發育過程,影響炎癥、感染等病理生理學過程[15]。LI等[16]研究發現,宮頸癌中miR-141-3p能夠在轉錄后水平誘導趨化因子插頭框A2的表達,促進腫瘤上皮間質轉化,導致腫瘤侵襲和轉移。本研究子宮內膜癌患者癌組織中miR-141-3p表達上調,且其表達與FIGO分期及淋巴結轉移有關,提示miR-141-3p促進子宮內膜癌的惡性進展。miR-141-3p表達上調的機制可能與長鏈非編碼RNA調控有關。有研究發現,長鏈非編碼RNA母系表達基因3(MEG3)能夠作為分子海綿結合并抑制miR-141-3p的表達及功能,乳腺癌中MEG3表達下調導致miR-141-3p升高,其通過抑制RNA結合模體單鏈作用蛋白3的表達,發揮促進腫瘤過度增殖和凋亡抑制的生物學作用[17]。既往研究表明,子宮內膜癌中存在MEG3表達下調的現象,其可能通過相似的機制,上調miR-141-3p的表達,促進子宮內膜癌的增殖、侵襲和轉移[18]。因此,子宮內膜癌中miR-141-3p可能作為一種促癌因子,參與促進子宮內膜癌的發生、發展。本研究中,miR-141-3p的表達與增殖基因PCNA mRNA、cyclinD1 mRNA、CDK4 mRNA表達呈正相關,提示miR-141-3p可能通過促進增殖基因的表達,促進子宮內膜癌的進展,分析其機制,miR-141-3p能夠與負調控增殖基因mRNA的3′非編碼區互補結合,促進mRNA的切割或翻譯抑制,降低mRNA的穩定性,進行促進細胞周期的進行。LI等[19]發現,在鼻咽癌中miR-141-3p的表達上調通過抑制腫瘤轉移抑制因子1的表達,促進蛋白激酶B的磷酸化激活,促進鼻咽癌的侵襲和轉移。BARDECK等[20]報道,miR-141-3p的表達上調能夠激活絲裂原活化的蛋白激酶途徑和細胞外信號調節激酶通路,促進下游細胞周期相關基因如CDK4等基因的表達,導致腫瘤細胞過度增殖。本研究結果顯示,miR-141-3p升高是影響子宮內膜癌患者預后的獨立危險因素,分析其原因,miR-141-3p升高的子宮內膜癌患者腫瘤惡性程度較高,腫瘤侵襲和轉移能力較強,導致子宮內膜癌患者預后不良[21]。有研究發現,前列腺癌中miR-141-3p的表達上調能夠通過抑制轉錄因子kruppel樣因子-9,促進癌細胞的干性的維持,增強腫瘤對化療的耐藥性,降低化療療效,導致患者不良預后[22]。因此,以miR-141-3p為靶點的治療方案可能有利于改善子宮內膜癌患者的臨床預后。

miR-149-3p基因位于人類染色體2q37.3,其作為一種短的調控RNA分子,在轉錄后水平調控下游基因如活化T細胞核因子4等的表達,與炎癥、免疫狀態等密切相關[23]。研究發現,卵巢癌中miR-149-3p能夠通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A的表達,促進腫瘤細胞由G1期向S期轉換,導致腫瘤細胞過度增殖[6]。本研究中,子宮內膜癌患者癌組織中miR-149-3p升高,且與腫瘤FIGO分期及淋巴結轉移有關,提示miR-149-3p參與子宮內膜癌的發生、發展。miR-149-3p表達受到復雜的非編碼RNA調控網絡調節,有學者發現,長鏈非編碼RNA ARAP1反義RNA 1(ARAP1-AS1)能夠作為分子支架,結合并抑制miR-149-3p的表達,但在宮頸癌中,ARAP1-AS1表達下調導致miR-149-3p升高,激活糖代謝過程中丙酮酸脫氫酶激酶2的表達,促進腫瘤細胞惡性增殖[24]。本研究中,miR-149-3p的表達與增殖基因PCNA mRNA、cyclinD1 mRNA、CDK4 mRNA表達呈正相關,提示子宮內膜癌中miR-149-3p升高能通過促進增殖基因的表達,促進子宮內膜癌的進展。有學者發現,前列腺癌中miR-149-3p升高可結合殘疾基因同源物2相互作用蛋白mRNA的3′非編碼區,抑制其蛋白表達,激活核因子-κB信號通路,促進了促炎細胞因子和促血管生成因子如血管內皮生長因子的表達,增強癌細胞的侵襲和轉移能力,導致前列腺癌的發生、發展[25]。本研究顯示,miR-149-3p升高是影響子宮內膜癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05),分析其原因,miR-149-3p作為一種腫瘤促進因子,其可通過促進腫瘤的惡性增殖及轉移,促進腫瘤的惡性進展,導致患者預后不佳[26]。

綜上所述,子宮內膜癌中miR-141-3p、miR-149-3p的表達與增殖基因PCNA mRNA、cyclinD1 mRNA、CDK4 mRNA表達呈正相關,二者可能通過激活增殖基因的表達,促進子宮內膜癌的發生、發展。miR-141-3p升高、miR-149-3p升高是影響子宮內膜癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。檢測子宮內膜癌患者癌組織中miR-141-3p、miR-149-3p表達有助于評估其生存預后。本研究尚也有不足之處,本研究樣本量有限,并且miR-141-3p、miR-149-3p在調控增殖基因表達的機制尚不清楚,有待今后進行深入基礎實驗研究。