禽多殺性巴氏桿菌檢驗用菌種的研究

馮 妍,張一幟,王秀麗,王 甲,劉 燕,姚文生,任小俠

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

禽多殺性巴氏桿菌病又稱禽霍亂,是由多殺性巴氏桿菌所引起的雞、火雞、鴨、鵝等禽類的一種出血性、敗血性傳染病,在各地呈散發(fā)性或地方性流行[1]。各種家禽、野禽對多殺性巴氏桿菌均易感染,發(fā)病率和死亡率高[2]。該病主要通過呼吸道、消化道及皮膚外傷感染發(fā)病,導(dǎo)致禽霍亂。通過對雞只的解剖檢查以及實驗室診斷可以準確地診斷疾病,幫助疾病的早期預(yù)防和治療[3]。目前對于該病的控制措施,主要采用的是四環(huán)素、氟苯尼考及鏈霉素治療,但易產(chǎn)生抗藥[4],且應(yīng)用時間較長時對禽體尤其是泌尿系統(tǒng)產(chǎn)生明顯毒害作用[5]。疫苗免疫也是防控該病的重要手段,發(fā)展安全高效的禽多殺性巴氏桿菌類疫苗以及對應(yīng)檢驗方法成為疾病防控的迫切需求[6]。目前禽多殺性巴氏桿菌類疫苗效力檢驗通常采用新鮮培養(yǎng)物進行預(yù)數(shù)菌,根據(jù)預(yù)數(shù)菌的結(jié)果再重新培養(yǎng)進行攻毒,兩次培養(yǎng)條件和結(jié)果很難達到完全一致,有可能會對效力評價結(jié)果產(chǎn)生一定影響。本研究制備了一批禽多殺性巴氏桿菌檢驗攻毒用凍干菌株,并對菌種的形態(tài)及生化特性、培養(yǎng)特性、血清學(xué)特性、真空度、純粹、剩余水分、毒力等進行檢定,進一步評估了凍干菌菌數(shù)的穩(wěn)定性,對凍干菌與新鮮培養(yǎng)菌液的毒力進行了比較。對于禽多殺性巴氏桿菌檢驗攻毒用菌株的研究有助于客觀評價不同的商品化疫苗,有利于提高生物制品檢驗的規(guī)范性和科學(xué)性,為疫苗質(zhì)量提升和迭代升級提供基礎(chǔ)方法支撐。

1 材料與方法

1.1 菌種 禽多殺性巴氏桿菌CVCC44801株,2000年3月22日由國家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心提供。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 馬丁肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(TG)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)、酪胨瓊脂培養(yǎng)基(GA)、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液(pH6.0)均購自北京中海生物技術(shù)有限公司;ID 32 E,購自Bio Mérieux公司;健康動物血清,購自PAN-BIOTECH;革蘭氏染液、瑞氏染液,購自北京索萊寶科技有限公司;普魯蘭多糖、海藻糖二水合物、PVP K30、甘露醇、硫脲,購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;無水氯化鈣,購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;蔗糖、明膠,購自BBI Life Sciences;綿羊脫纖血、綿羊裂解血球全血,實驗室自制。多殺性巴氏桿菌A群定型血清、多殺性巴氏桿菌B群定型血清、多殺性巴氏桿菌D群定型血清,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 實驗動物 SPF雞,91日齡、111日齡,購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

1.4 凍干保護劑的配置 普魯蘭多糖0.5 g、蔗糖3.5 g、海藻糖二水合物6.0 g、明膠2.0 g、PVP K30 0.2 g、甘露醇0.2 g、硫脲1.2 g、無水氯化鈣1.11 g,溶于100 mL蒸餾水,混勻,調(diào)pH至7.3。

1.5 菌種制備 取菌種進行真空度檢測,出現(xiàn)輝光,真空度良好。開啟菌種用1.0 mL馬丁肉湯溶解,接種于含0.1%裂解血球全血及4%健康動物血清的改良馬丁瓊脂平板3付,37 ℃培養(yǎng)16 h。之后挑取該平板上的典型Fo菌落,接種于含0.1%裂解血球全血的馬丁肉湯培養(yǎng)24 h,原液肌肉注射111日齡SPF雞1只,1 mL/只。SPF雞于24 h內(nèi)死亡,剖檢,分離細菌。取肝臟組織和心血分別接種于含0.1%裂解血球全血及4%健康動物血清的改良馬丁瓊脂平板,37 ℃培養(yǎng)24 h。挑選單個典型Fo型菌落接種于接種改良馬丁瓊脂中管培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h。在改良馬丁瓊脂中管斜面培養(yǎng)物中加入凍干保護劑,混合均勻分裝,每支0.5 mL,進行凍干,制備完成效力評價禽多殺性巴氏桿菌菌種1株。

1.6 菌種的檢定

1.6.1 真空度測定、純粹檢驗及剩余水分檢定

根據(jù)2020年版《中國獸藥典》進行檢驗[7]。

1.6.2 培養(yǎng)特性檢定 用接種環(huán)刮取少量菌體在含4%健康動物血清及0.1% 裂解血細胞全血的改良馬丁瓊脂平板上劃線培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng)16 h,觀察菌落形態(tài)。

1.6.3 形態(tài)和生化特性檢定 取新鮮培養(yǎng)的改良馬丁瓊脂平板上的菌體進行革蘭氏染色,鏡檢;取毒力檢定中死亡的SPF雞進行剖檢,取肝臟組織涂片,進行瑞氏染色,鏡檢。使用ID 32 E快速鑒定試劑盒參照使用說明書進行生化特性檢查。

1.6.4 血清學(xué)特性檢定 用磷酸鹽緩沖液將改良馬丁瓊脂平板上新鮮培養(yǎng)的菌體洗下,加入透明質(zhì)酸酶溶液。混勻后,至于37 ℃水浴4 h,8000 r/min離心20 min,取含有莢膜抗原的上清液與新鮮紅細胞混合,置37 ℃培養(yǎng)24 h,1500 r/min離心10 min,棄上清液,留致敏的紅細胞,用生理鹽水配成1%的致敏紅細胞懸液。將A、B、D型定型血清56 ℃水浴30 min后,作1∶5倍稀釋,然后各管加1%致敏紅細胞懸液。血清對照:A、B、D定型血清稀釋液+1%正常紅細胞液混合;抗原對照:1%致敏紅細胞懸液+生理鹽水;血球?qū)φ?1%正常紅細胞懸液+生理鹽水;各管混勻后,置37 ℃培養(yǎng)箱作用2 h,觀察是否出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。

1.6.5 穩(wěn)定性檢定 凍干后0、1、3、6、12個月,隨機抽取3支凍干菌種進行活菌計數(shù)。

1.6.6 毒力檢定 根據(jù)均一性檢定結(jié)果,取凍干菌種直接用馬丁肉湯稀釋至8、4、2 CFU/mL,1 mL/只肌肉注射SPF雞各4只,應(yīng)于3日內(nèi)全部死亡。同時取新鮮培養(yǎng)菌液,用馬丁肉湯稀釋至8、4、2 CFU/mL,1 mL/只肌肉注射SPF雞各4只。

2 結(jié)果與分析

2.1 真空度測定 對凍干菌種進行真空度測定,均呈現(xiàn)白色或紫色輝光,符合規(guī)定。

2.2 純粹檢驗 抽取5支真空度測定良好的菌種進行純粹檢驗,結(jié)果5/5符合規(guī)定。

2.3 剩余水分測定 抽取4支真空度測定良好菌種進行剩余水分測定,剩余水分測定結(jié)果為1.4%、1.2%、1.7%、1.4%,符合規(guī)定。

2.4 培養(yǎng)特性檢定 肉眼觀察培養(yǎng)16 h的菌落狀態(tài),菌落表面光滑,呈微藍色;在低倍顯微鏡下,45度折光觀察,菌落結(jié)構(gòu)細致,邊緣整齊,呈桔黃色,屬Fo菌落型。

2.5 形態(tài)和生化特性檢定 挑取新鮮培養(yǎng)物進行革蘭氏染色,結(jié)果為革蘭氏陰性桿菌,對毒力檢驗中死亡的SPF雞進行剖檢,取肝臟組織涂片,瑞氏染色為兩級著色球桿菌,生化檢定結(jié)果符合禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)特性,見表1。

表1 CVCC44801菌種生化特性檢定結(jié)果Tab 1 Biochemical characteristics results of strain CVCC44801

2.6 血清學(xué)特性檢定 結(jié)果見表2。莢膜抗原與B型、D型血清無凝集反應(yīng),與A型定型血清有凝集反應(yīng),(表2)。判定血清學(xué)特性檢定結(jié)果均符合規(guī)定。

表2 CVCC44801菌種血清學(xué)特性檢定結(jié)果Tab 2 Serological characterization results of strain CVCC44801

2.7 穩(wěn)定性檢定 凍干后0、1、3、6、12個月,隨機抽取3支凍干菌種進行活菌計數(shù),將保存1、3、6、12個月的凍干菌種分別與保存0個月的凍干菌種菌數(shù)進行t檢驗比對分析。結(jié)果顯示,凍干菌種在-70 ℃保存1月、3月、6月、12月與保存0個月的菌數(shù)無顯著性差異(P>0.05),該凍干菌種在-70 ℃保存條件下穩(wěn)定性良好。結(jié)果見表3和圖1。

圖1 CVCC44801菌種穩(wěn)定性檢定試驗結(jié)果Fig 1 Stability test results of strain CVCC44801

表3 CVCC44801菌種穩(wěn)定性檢定試驗結(jié)果Tab 3 Stability test results of strain CVCC44801

2.8 毒力檢定 將-70 ℃以下保存9個月的CVCC44801株凍干菌種稀釋至10-7,取5 mL菌種加入7.5 mL培養(yǎng)基,再進行2倍稀釋,1 mL/只肌肉注射SPF雞各4只,注射劑量經(jīng)復(fù)數(shù)為7、3、2 CFU/只。取凍干菌種24 h培養(yǎng)物進行活菌計數(shù),根據(jù)活菌計數(shù)結(jié)果,相同培養(yǎng)條件培養(yǎng)攻毒菌液,按照活菌計數(shù)結(jié)果稀釋至10-7,取10-7菌液1 mL+16.75 mL培養(yǎng)基再進行2倍稀釋,1 mL/只肌肉注射SPF雞各4只,注射劑量經(jīng)復(fù)數(shù)為7、4、2 CFU/只(表4)。

表4 CVCC44801菌種毒力檢定試驗結(jié)果Tab 4 Virulence test results of strain CVCC44801

3 討論與小結(jié)

本研究檢定該批禽多殺性巴氏桿菌CVCC44801株培養(yǎng)特性、形態(tài)及生化特性、血清學(xué)特性、毒力、純粹、剩余水分及真空度項目均符合《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》二〇〇〇年版菌種標準的規(guī)定[8]。使用新鮮培養(yǎng)的攻毒菌液與凍干的攻毒菌株進行比較,毒力無明顯差異。目前禽多殺性巴氏桿菌類滅活疫苗效力檢驗存在的主要問題有:(1)效力檢驗用菌株受培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及菌株篩選因素影響,預(yù)試驗與正式攻毒偏差大[9];(2)同一類型不同企業(yè)產(chǎn)品效檢用菌毒種差異大,企業(yè)間檢驗水平參差不齊。為全面客觀評價行業(yè)內(nèi)疫苗質(zhì)量,亟需建立通用的效檢菌株標準物質(zhì)對毒力、穩(wěn)定性等指標進行統(tǒng)一。針對以上問題,通過本研究制備的凍干菌株,復(fù)溶后直接進行攻毒,可不受培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等因素對菌液培養(yǎng)的影響,從而避免了菌數(shù)不穩(wěn)定導(dǎo)致的實驗偏差。另一方面通過實驗驗證了凍干菌種的毒力和穩(wěn)定性,證明其具備替代新鮮菌液攻毒的能力。現(xiàn)有的禽多殺性巴氏桿菌類生物制品,都使用CVCC44801株進行效力檢驗,可對不同企業(yè)的產(chǎn)品質(zhì)量提供統(tǒng)一評價。并且與傳統(tǒng)的蔗糖牛奶以及明膠類凍干保護劑相比較,本研究采用復(fù)合型保護劑添加糖類、醇類、聚合物、鹽類等,糖類能抑制蛋白的變性[10],醇類能加速凍干的干燥過程防止蛋白質(zhì)之間相互作用導(dǎo)致的變性[11],聚合物能促進胞外粘性層形成保護細胞膜[12],通過不同保護機制成分共同協(xié)同促進[13],有效提高凍干菌種的穩(wěn)定性。本研究通過對禽多殺性巴氏桿菌CVCC44801株的制備及檢定,為相關(guān)獸用生物制品效力評價用菌株的研究提供了參考。