細菌內毒素檢查法評審要點與注冊資料常見問題分析

韓寧寧,趙富華,王 軒,彭文繡,汪 霞

(中國獸醫藥品監察所,北京 100081)

細菌內毒素是獸藥注射劑中最主要和最易導致熱原反應的污染物,其為革蘭氏陰性菌細胞壁上的脂多糖(LPS)成分,在細菌死亡或自溶后釋放。細菌內毒素由三部分構成:O-特異性側鏈、核心多糖和類脂A,其中類脂A是LPS的主要毒性[1]。內毒素可能會在革蘭氏陰性菌死亡后在細胞壁片段中保持活性,因此,供試品可能是無菌的,但仍可能檢測出內毒素。注射劑中存在細菌內毒素時,表明在產品生產過程中的某一個或幾個節點存在革蘭氏陰性菌的污染[2]。為保證獸藥注射劑的安全可控,《中國獸藥典》附錄0102規定,靜脈用注射劑必須進行細菌內毒素的檢查[3]。

新獸藥細菌內毒素檢查方法建立的過程,涉及到內毒素限值的制定、最大稀釋倍數(MVD)或最小稀釋濃度(MVC)的計算、藥物前處理、干擾試驗的設計與驗證等多個關鍵步驟。產品申報方應按照《中國獸藥典》附錄1143細菌內毒素檢查法的相關要求[4],結合自身產品特點和國內外相關研究現狀,制定適宜的內毒素檢查方法。與此同時,申報方亦應關注該方法的技術評審要點,避免方法建立過程中的常見問題,保證方法的準確可靠。

1 細菌內毒素限值制定的相關評審要點與常見問題

細菌內毒素的限值是指動物對獸藥中細菌內毒素所能耐受的不致引起熱原反應的臨界值(L)。其計算公式為:L=K/M。

式中,L根據供試品給藥方式的不同,一般以EU/mL、EU/mg或EU/U表示。

K為每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量。目前,《中國獸藥典》中的K值借鑒了人用藥[5]的相關指標,即注射劑K=5EU/(kg·h),放射性注射劑K=2.5EU/(kg·h),鞘內用注射劑K=0.2EU/(kg·h)。需要注意的是,由于動物與人體對內毒素耐受程度存在差異,不同動物品種之間對內毒素耐受程度亦存在差異,采用同一K值用于不同動物的內毒素限值計算存在一定的偏差。

M為每千克體重每小時的最大供試品單次劑量。當供試品的用法用量為頻繁間隔注射或連續輸注時,M為每小時給藥的最大總劑量。M的單位應與供試品給藥方式相適應,例如,當供試品按體積給藥時,M以mL/kg表示;當供試品按重量給藥時,M以mg/kg表示;當供試品以生物活性單位給藥時,M以U/kg表示;當供試品可用于多個動物品種時,應使用最小動物品種使用的最大供試品劑量;當幼年動物的每千克體重劑量高于成年動物時,應使用幼年動物的每千克體重劑量。

新獸藥產品,可以根據上述公式結合產品給藥方式進行計算以制定內毒素限值。另外,對于仿制藥品種,可以參考原研產品的限值;當國際藥典等法定標準收載相應產品時,亦可參考法定標準的限值。

評審過程中最常見問題是注冊資料中缺少限值的制定依據或計算過程,僅提供了干擾試驗的驗證過程和產品的檢測結果。而限值的制定是評價該檢查項是否可良好反映產品安全性的重要依據,更是后續稀釋倍數計算和干擾試驗設計的前提。因此,申報方應充分闡述相應產品內毒素限值的制定過程。

第二個常見問題是混淆了原料限值與制劑限值的推導邏輯關系。內毒素限值是根據注射劑的給藥方式和動物耐受程度計算出的結果。當制劑限值確定時,可根據產品含量規格,推導出原料的限值[6]。例如,某注射液限值是10 EU/mL,規格是2 mg/mL,則對應原料限值是10÷2=5 EU/mg。但是,根據原料限值推導制劑限值則是不合邏輯的推導過程。

第三個常見問題是,當同時申報無菌原料與制劑時,二者的內毒素限值存在較大差異又缺乏合理解釋。例如,某企業申報注冊的布舍瑞林注射液限值為50 EU/mL;同時申報的布舍瑞林原料內毒素限值參考了EP標準,為55.5 EU/mg。該注射液規格為4.2 μg/mL,推算原料限值應為50÷0.0042=11905 EU/mg,與55.5 EU/mg差異巨大。申報方并未提供注射液除主藥外其他成分的內毒素測定情況,無法合理解釋制劑中內毒素來源,評審員則有理由質疑注射液限值計算過程的合理性。

2 MVD或MVC計算的相關評審要點與常見問題

MVD指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數,在不超過此稀釋倍數的濃度下進行內毒素的檢測。其計算公式為MVD=cL/λ,其中L為供試品的內毒素限值;c為供試品溶液的濃度;λ在凝膠法中為鱟試劑的標示靈敏度(EU/mL),在光度測定法中為所使用的標準曲線上最低的內毒素濃度。如供試品為注射用無菌粉末或原料藥,MVD=1,計算MVC=λ/L。以下三個實例演示MVD或MVC的計算過程:

某注射液規格為20 ml:5 g,內毒素限值L=0.50 EU/mL,鱟試劑λ=0.125EU/mL,則MVD=cL/λ=1×0.50/0.125=4。

某注射液規格為20 ml:5 g(250 mg/mL),內毒素限值L=0.50 EU/mg,鱟試劑λ=0.125 EU/mL,則MVD=cL/λ=250×0.50/0.125=1000。

某注射用粉針內毒素限值L=0.50 EU/mg,鱟試劑λ=0.125 EU/mL,則MVC=λ/L=0.125/0.50=0.25 mg/mL。

評審過程中最常見問題是MVD與MVC混淆。例如,某企業申報注冊泰拉霉素原料,材料中說明了MVD的計算過程,并根據MVD進行了稀釋。但無論稀釋過程正確與否,原料均應計算MVC而非MVD。

第二個常見問題是未根據限值L的單位進行合理的MVD計算。例如,某企業申報某注射液規格為20 mL:5 g(250 mg/ml),內毒素限值為L=0.50 EU/mL,鱟試劑λ=0.125 EU/mL。申報材料將L的單位EU/mL轉化為了EU/mg,即L=0.50/250=0.002 EU/mg,又進而計算MVC=λ/L=0.125/0.002=62.5 mg/mL,再反過來推算MVD=250/62.5=4。但如前所述,僅供試品為注射用無菌粉末或原料藥時才進行MVC的計算。當L以EU/mL表示時,c取1 mg/ml,可直接計算MVD=1×0.50/0.125=4。雖然兩種計算方法的稀釋倍數結果是一致的,但前者反映了申報方對MVD、MVC存在概念的理解差異和應用錯誤。

3 細菌內毒素檢查實驗材料的相關評審要點與常見問題

細菌內毒素檢查法涉及的實驗材料包括細菌內毒素標準品、細菌內毒素檢查用水、鱟試劑、溶劑、緩沖液或酸堿調節劑等。其中,細菌內毒素標準品又分為國家標準品(RSE)和工作標準品(CSE)。我國法定的國家標準品和工作標準品均由中國食品藥品檢定研究院生產和組織協作標定賦值[7]。需要注意的是,我國與其他國家對內毒素工作標準品的管理和使用有較大差別。例如,美國RSE由美國食品藥品監督管理局(US Food and Drug Administration, FDA)生產并組織協作標定賦值,CSE由鱟試劑生產廠家生產并根據 RSE來標定[8]。在進行細菌內毒素檢查時,如果使用的是我國的鱟試劑,則應選擇使用中國的標準物質。如果使用的是進口鱟試劑,則應按其要求使用對應的內毒素標準物質,不宜交叉使用。

評審中最常見的問題是使用了非法定來源的工作標準品,例如我國國內某些鱟試劑生產廠家亦可提供工作標準品,但申報材料中未對該工作標準品的賦值進行相應標定或確認。

第二個常見問題是選擇的鱟試劑靈敏度與內毒素限值不匹配。例如,某注射液內毒素限值L為0.2 EU/mL,則相應鱟試劑靈敏度應至少不低于對應限值,可選擇λ=0.125 EU/mL甚至更高靈敏度的鱟試劑。但需要注意的是,鱟試劑的靈敏度并非越高越好,因為靈敏度越高意味著稀釋倍數的增加,也就意味著操作步驟和實驗用品消耗的增加,除了增加實驗成本外,還使得引入外源性內毒素的風險加大。

4 細菌內毒素檢查實驗過程的相關評審要點與常見問題

新獸藥細菌內毒素檢查方法的建立,應包括細菌內毒素限值的確定、適宜靈敏度鱟試劑的選擇、MVD或MVC的計算、鱟試劑的靈敏度復核、供試品干擾試驗、產品的細菌內毒素檢查等關鍵步驟。當沒有相關研究資料可參考時,在進行干擾試驗之前,還需要設計干擾試驗預實驗,以預測供試品不產生干擾的濃度范圍[9]。按照《中國獸藥典》的相關要求,應選擇至少兩個廠家的鱟試劑對至少三批產品進行干擾試驗。另外,需要注意的是,若無法排除供試品對細菌內毒素檢查的干擾作用或只能使用最高靈敏度鱟試劑(凝膠法 0.03 EU/mL,光度法0.001 EU/mL),則表明該產品不適宜采用常規方法進行細菌內毒素檢查[10]。

評審中最常見的問題是缺少鱟試劑靈敏度復核資料,或干擾試驗的鱟試劑廠家數或產品批數不符合法規最低要求。

第二個常見問題是僅使用了最高靈敏度的鱟試劑,而未加以其他靈敏度鱟試劑實驗數據來佐證,尤其是在產品中存在β-葡聚糖等輔料干擾[11],或產品因pH值偏酸或偏堿等因素可能引起干擾時,評審員則有理由質疑產品采用常規方法是否可充分排除干擾。

5 細菌內毒素檢查質量標準的相關評審要點與常見問題

當采用常規試劑和常規配制方法即可完成細菌內毒素檢查時,相應質量標準按照《中國獸藥典》格式表述,即“取本品,依法檢查(附錄1143),每1 mL(mg)**中含內毒素的量不得過**”。但如果使用了特殊的溶劑、緩沖液或酸堿調節劑,或采用了特殊的供試品前處理方法,如萃取、離心等,則應在質量標準中注明。

評審中最常見的問題是方法驗證中所用試劑或前處理方法與質量標準不一致。例如,某企業申報泰拉霉素注射液,方法驗證資料表明采用了特定配方的堿性調節劑方可消除干擾,但最終的質量標準僅按《中國獸藥典》常規格式表述。這種情況極易導致產品的注冊檢驗無法復現申報企業的檢驗結果,進而導致產品的退審。

第二個常見問題是在標準中僅注明所用試劑的廠家來源,但未注明試劑配制方法。這種情況在進口獸藥產品中最為常見。產品首次申報時,由申報企業提供相應試劑,并不影響注冊檢驗。但在后續的監督檢驗中,限制了試劑的采購來源,尤其是有些進口試劑難以采購,又沒有相應配制方法,不利于對產品的質量控制和監督。

6 小 結

新獸藥細菌內毒素檢查方法的建立,應從限值制定、試驗設計、試驗過程、質量標準制訂等多個環節進行規范。注冊資料中,限值制定應詳細闡述計算過程或參考的標準; MVD或MVC的計算,應注意根據品種及限值的單位選擇適宜的計算公式;干擾試驗應注意選擇法定的工作標準品和適宜靈敏度的鱟試劑,并排除樣品本身對測定的干擾;質量標準的制訂應與驗證試驗內容一致,涉及特殊試劑或處理方法應在標準中加以說明。細菌內毒素檢查全過程的規范與控制,為獸藥注射劑的安全可控奠定了基礎。