豬圓環病毒2型疫苗及其效力評價方法比較研究

徐 嫄,彭國瑞,徐小艾,吳睿智,趙啟祖,朱元源,李 翠,王團結,鄒興啟,李 琰,劉業兵

(中國獸醫藥品監察所,北京 100081)

豬圓環病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是圓環病毒科(Circoviridae)圓環病毒屬(Circovirus)成員,病毒粒子無囊膜,呈二十面體對稱結構,基因組為閉環單股DNA,直徑20 nm左右,是迄今發現的最小的動物病毒。自20世紀80年代以來,由PCV2感染引發的“豬圓環病毒相關疾病”(porcine circovirus-associated disease,PCVAD/PCVD)對養豬業造成了嚴重威脅,是影響全球生豬生長的重要經濟問題之一[1-2]。PCVD的臨床表現包括PCV2系統性疾病(PCV2-SD),以前稱為仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征(PMWS),和PCV2亞臨床感染(PCV2-SI)[3-5]。PCV2-SD嚴重感染的豬會有高病毒血癥、組織內高滴度的病毒、淋巴組織的衰竭和肉芽腫性炎癥等表現,并且常出現和其他病原體共感染的情況[6-7]。而PCV2-SI引發的非典型的臨床癥狀,也直接導致了生產性能降低[8-9]。

隨著越來越多的PCV2毒株被分離鑒定和基因分型方法的發展,PCV2出現了越來越多的基因型[10],其中,PCV2a、PCV2b、PCV2d先后成為流行于我國的優勢基因型,并且PCV2d已在我國形成較大流行[11-13]。PCV2滅活疫苗的早期應用對于預防和控制PCVD發揮了關鍵作用。隨后,PCV2基因工程亞單位疫苗、合成肽疫苗相繼研發成功并應用。根據國家獸藥基礎數據庫顯示,目前PCV2疫苗產品的批準文號近70個,生產企業40余家,涉及生產用PCV2毒株10余個[14],且已有5個國外商品化PCV2疫苗在我國取得了《進口獸藥注冊證書》。面對田間PCV2流行毒株的變化,如何科學、務實地對眾多PCV2疫苗產品的效力與田間流行毒株的匹配程度進行統一評價是具有挑戰性的工作。本文旨在對各種PCV2疫苗及其效力評價方法進行比較研究,以期為探索統一的PCV2效力評價方法和標準提供參考。

1 PCV2疫苗概況

1.1 PCV2疫苗種類 PCV2疫苗作為養豬行業防控PCVD的有效手段受到高度重視。由法國梅里亞公司研發的PCV2全病毒滅活疫苗Circovac于2006年上市;隨后,我國多個科研團隊研發的PCV2滅活疫苗SH株、LG株、DBN-SX07株等陸續上市[15-17]。PCV2疫苗產品以傳統的滅活疫苗數量居多,包括單苗和聯苗,此外還包括,以PCV1為骨架嵌合PCV2 ORF2基因的嵌合體疫苗,通過大腸桿菌或桿狀病毒昆蟲細胞表達PCV2免疫原性蛋白Cap研發而成的亞單位疫苗,和按照抗原氨基酸序列人工方法合成保護性短肽而研制的合成肽疫苗。其中,亞單位疫苗已經成為近幾年的研究熱點,表達衣殼蛋白Cap的亞單位疫苗有較好的免疫原性和安全性,但生產成本較高。PCV2弱毒疫苗、活載體疫苗、核酸疫苗目前均僅在實驗室研究階段[18-20]。在2022年,我國PCV2疫苗的批簽發數量僅次于豬瘟疫苗和偽狂犬病疫苗,位居豬病毒類疫苗批簽發第三位,國內生產企業超過40家,其中國產單苗和聯苗共20個,進口疫苗產品5個,詳細見表1。

表1 我國已批準使用的商品化PCV2相關疫苗Tab 1 Approved commercial PCV2 vaccines in China

1.2 毒株及基因型 隨著PCV2感染在全世界范圍內的發生和流行,對各地PCV2毒株之間的系統發育關系研究逐漸深入。根據對衣殼蛋白Cap基因的成對序列比較法,2008年提出PCV2基因型的定義,并且已鑒定的基因型有PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e[21]。近些年的研究表明,新基因型的出現可能源于動物體內感染的不同毒株間的重組,而現有的分類方法已不能適用所有PCV2毒株。我國流行毒株的基因型為PCV2a、PCV2b、PCV2d。目前國內滅活疫苗PCV2毒株基因型包括PCV2a、PCV2b、PCV2d,并且疫苗毒株的數量隨著新產品的上市也在逐漸增加。

1.3 用法與用量 由于疫苗毒株、技術路線、抗原含量以及聯用情況的不同,各疫苗的用法與用量也存在差異,主要表現在以下兩方面。

1.3.1 仔豬首免日齡及是否需要加強免疫 首免日齡的選擇是權衡母源抗體水平與疫苗效力受其影響程度的結果,已批準的疫苗中,有2/3選擇14～21日齡(2周齡)首免,其余選擇21日齡(3周齡)首免;而是否需要加強免疫則是權衡接種量(抗原含量)與預期效力及安全性(不良反應)的結果,已批準的疫苗中,半數的國產疫苗接種量定為1 mL/頭的疫苗需要間隔2或3周進行加強免疫,接種量定為2 mL/頭的疫苗通常未作要求。進口疫苗均是單次免疫。

1.3.2 成年豬的免疫程序 已批準的疫苗中,部分疫苗明確寫明可用于成年母豬(后備、懷孕、經產)及種公豬,但免疫程序各有規定。對于成年母豬,通常要在配種前至分娩前的生產階段進行多次免疫,目的是在保護母豬的同時為新生仔豬準備充足的母源抗體;對于種公豬在內的其他成年豬,通常要求根據疫苗免疫期定期免疫。

2 PCV2疫苗效力檢驗方法比較分析

有效性是疫苗的一項重要評價指標,直接影響了疫病防控的效果。PCV2疫苗效力檢驗方法包括體內效力檢驗法和體外效力檢驗法。前者是通過免疫接種靶動物或替代靶動物的實驗動物后,檢測其免疫攻毒保護率或誘導產生的抗體效價;后者則是不使用動物,通過生化或免疫學等方法檢測其中的抗原含量,以間接評價疫苗效力[22]。下文將對PCV2疫苗效力檢驗方法進行分析。

2.1 體內效力檢驗法

2.1.1 靶動物免疫攻毒法 靶動物免疫攻毒法是獸用疫苗最常用且最直觀的效力檢驗方法。PCV2的易感動物是豬。對血清、鼻腔分泌物和糞便中的動態研究發現,大多數豬在4～11周齡感染PCV2,感染母豬可通過胎盤感染胎兒,并通過呼吸道分泌物、初乳等傳染給哺乳仔豬[23-24]。受PCV2單一病原感染的豬往往僅出現亞臨床癥狀,早期病癥較為隱匿,較難呈現典型直觀的發病模型[25-26]。PCV2疫苗效力檢驗用豬的日齡范圍最低至10日齡,最高至35日齡,不同質量標準在檢驗用豬日齡上的要求有所不同,最為常見的范圍是14～21日齡。免疫程序分為單次免疫和兩次免疫,免疫后2～5周進行攻毒,攻毒前后是否有免疫刺激,依不同標準而定,目前進口疫苗都無需該步操作。由于攻毒后發病溫和,發病的判定較為困難,因此標準中往往結合多項指標綜合判定,主要包括體溫變化、相對日增重差異、免疫組織化學法(immunohistochemistry,IHC)檢測病毒抗原、DNA擴增技術(polymerase chain reaction/ quantitative real-time polymerase chain reaction, PCR/qPCR)檢測血液或組織中的病毒抗原、間接免疫熒光(indirect immunofluorescence assay,IFA)檢測組織中分離培養的病毒抗原等方法,進行判定和評價。其中,病毒分離方法因操作復雜、耗時長,且受細胞敏感性的影響,可能導致病毒滴度降低,而影響檢測敏感度,國內外都少有使用。國內產品多以檢測病毒抗原、相對日增重和體溫變化綜合判定發病。進口疫苗產品則多是在攻毒后以IHC和PCR/qPCR檢測病毒抗原,結合統計學分析進行結果判定,各組動物數量往往不低于10只,較國內各組動物5～6只多出至少一倍。

有超過一半的PCV2疫苗產品的抗原檢測使用PCR/qPCR。其中有多數疫苗產品使用普通PCR,僅有5個產品使用qPCR?；赥aqman探針的PCV2 的qPCR檢測方法的靈敏度約是普通PCR的100倍。IHC是幾乎所有產品都用到的抗原檢測技術,IHC通過標記的抗體或抗原對細胞相應抗原或抗體進行定性、定位或定量檢測,經過化學呈色反應,用顯微鏡或電子顯微鏡觀察結果。PCV2感染后的病理表現主要見于淋巴組織,應用該方法檢測PCV2抗原采集的病料包括:腹股溝淋巴結、腸系膜淋巴結、肺門淋巴結、支氣管淋巴結和扁桃體等。IHC在PCV2-SD的個體診斷中發揮了重要作用,同時也要求實驗人員熟練掌握組織病理學操作技術。

靶動物免疫攻毒法有以下幾方面值得注意。第一,選用靶動物免疫攻毒法進行效力檢驗的PCV2疫苗,需要使用各自質量標準中的攻毒毒株進行攻毒,所用攻毒毒株繁多且毒力強弱有別,從而導致發病模型存在差別;第二,尚未統一標準實驗用豬,因日齡和健康背景不同,產生的免疫應答存在差異,也是導致發病模型差異的原因;第三,目前的發病判定方法較多且尚未統一,尚未科學地比較方法的優劣?？梢?目前評價PCV2疫苗效力的靶動物免疫攻毒法無法對眾多疫苗進行統一的效力評價和比較。此外,隨著PCV2疫苗臨床接種率的逐年上升和其他感染因素的存在,篩選雙陰性仔豬的難度也隨之增大。

2.1.2 小鼠免疫攻毒法 小鼠是應用最廣泛的實驗動物,研究表明,PCV2可以人工感染Balb/c小鼠、C57BL/6小鼠、C3H/HeJ小鼠、ICR小鼠等嚙齒動物,小鼠作為PCV2感染的動物模型,已用于病毒與宿主相互作用研究、疫苗效力評估、抗病毒藥物和疫苗佐劑的評估[27]。吳佳鑫[28]對6～8周齡SPF級Balb/c小鼠進行免疫攻毒保護研究,攻毒后第三天,應用qPCR方法可在小鼠多個臟器組織中檢測出病毒,試驗疫苗可對小鼠提供一定的保護。目前僅有一個國內產品的效力檢驗同時涉及仔豬免疫攻毒法和小鼠免疫攻毒法,通過采集組織,進行病毒分離培養,比較免疫組和對照組的病毒分離結果來評價免疫效果。用易感的小型實驗動物進行免疫攻毒效力檢驗能夠降低檢驗成本和操作難度,但因物種差異,可能導致與靶動物免疫攻毒評價結果不一致,故需要經過大量試驗驗證兩者的平行關系。

2.1.3 血清學檢驗法 血清學檢驗法屬于體內效力檢驗方法,國內外PCV2疫苗產品多有應用該方法評價疫苗的免疫效果,使用的動物同樣是雙陰性健康仔豬和Balb/c小鼠。接種疫苗2～3周后,產生針對PCV2的特異性免疫應答,血清中的特異性抗體水平能夠反應疫苗的保護效果。PCV2疫苗中,涉及血清學效力評價方法的產品占到半數以上,其中三分之一使用小鼠免疫試驗,不同產品的免疫程序和采血時間存在差異,判定方法和標準也不一致。

通過對免疫動物的血清抗體效價進行檢測,評價疫苗的保護效果,使用最多的檢測方法是酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA),其次是免疫過氧化物酶單層細胞試驗(immunoperoxidse monolayer cell assay,IPMA)和間接免疫熒光檢測,后兩種方法需要進行細胞培養,耗時較長,對人員操作水平要求較高。ELISA是檢測血清中抗體水平的常用方法,目前國內已有商品化豬PCV2抗體檢測試劑盒,吳華偉[29]曾對5種試劑盒進行評價,發現不同產品在敏感性和符合率上的差別較大。ELISA方法對試劑盒質量提出了更高的要求。

2.2 體外效力檢驗法

2.2.1 相對效力法 相對效力法即參考疫苗法,基于量反應平行線測定法和ELISA原理,將被檢疫苗與已經檢驗合格或經靶動物免疫攻毒試驗證明效力合格的參考疫苗同時進行檢測,檢驗結果成立時,通過軟件計算被檢疫苗的相對效力值,每次檢測樣品時不需要重復建立標準曲線[30]。該方法是一種操作簡單,省時高效的替代方法。近三分之一的PCV2疫苗使用了相對效力法。參考疫苗在其中尤為關鍵,只有制備出質量可靠的參考疫苗才能對樣品進行有效評價。近年來對該方法的應用逐漸增多。參考疫苗作為標尺必須確保其具有優秀的保護力和穩定性,并且與免疫攻毒法具有高度相關性。目前,不同疫苗的效力檢驗使用的參考疫苗都由各研發單位制備,尚無通用性參考疫苗,因此該方法無法客觀統一地對產品進行比較[31]。

2.2.2 抗原含量測定法 疫苗中抗原含量的高低直接影響到疫苗的免疫效果。目前的PCV2疫苗產品中分別有一個滅活疫苗和一個亞單位疫苗對抗原含量進行測定,測定方法包括瓊脂擴散試驗法、BCA蛋白含量檢測法和夾心ELISA法。瓊擴法的結果受多種因素影響,對抗原的定量而言準確性較差。其他兩種方法結果的準確性也同樣受試劑質量影響。隨著分離純化技術的發展,色譜技術越來越多地被用于獸用生物制品的質量控制,應用高效體積排阻色譜技術(high performance size exclusion chromatography, HPSEC)檢測PCV2疫苗中抗原含量的方法已初步建立,但由于疫苗的研發工藝不同,疫苗中成分復雜等因素,想要建立通用的抗原含量測定方法尚需要大量的研究工作[32]。

3 討論與展望

PCV2對豬群健康造成了持續且廣泛的影響,接種疫苗是目前最有效的防控措施。隨著病毒流行趨勢的復雜多變、研發技術的革新以及使用者對疫苗效果的更高期待,新型疫苗產品層出不窮,從而增大了對該類產品的質量評價和監管難度。

從廣義上講,效力評價是伴隨疫苗全生命周期的、重復而漸進的、最為關鍵的事件之一,包括研發早期探索階段的概念驗證(proof-of-concept,POC)效力評價、以申報注冊為目標的實驗室和臨床效力評價、申報注冊過程中必要的第三方或官方效力評價(臨床驗證或復核檢驗)、完成上市許可之后的出廠檢驗效力評價以及客戶或官方要求的準入或監督效力評價。就單一產品而言,其效力評價方法在上述演變過程中,應當遵從化繁為簡、深入淺出的原則;尤其是完成上市許可之后的效力評價,應以穩定的生產工藝和符合良好生產管理規范(good manufacturing practice, GMP)的生產過程為基石,科學、客觀、精準地反映產品的預期保護力,而這正是本文所關注的產品質量標準的效力評價方法。由于病原及疫病的特殊性,在實驗室內使用健康靶動物進行“攻毒造病”難免會因為生物源因素(實驗動物個體及批次差異)、攻毒材料因素(來源、毒力差異)以及人源因素(操作、判定差異)等,而極易出現偏差、甚至不可重復。就PCV2及其造成的PCVD而言,病原在不同年齡段靶動物中展現的毒力差異明顯,各強毒力毒株在同一年齡段靶動物中展現的毒力也難言一致,且在臨床環境變化及高強度免疫壓力下,流行毒株也隨之演變,所帶來的是更多的亞臨床感染和癥狀,給疫病防控帶來壓力的同時,也提升了效力評價的難度。

實現對眾多PCV2疫苗產品進行統一的效力評價,是一項極具挑戰的工作。體內效力檢驗靶動物免疫攻毒法是當前應用最為廣泛的方法,但在靶動物篩選標準、發病指標、保護標準、攻毒毒株及免疫攻毒程序等關鍵方面,各疫苗廠家均制定了“專屬”標準,若要統一建立通用于所有疫苗的體內效力檢驗方法,需開展包括通用靶動物篩選及供應保障,通用攻毒毒株流調、篩選、建庫及更新判定,通用免疫攻毒程序、發病及保護標準探索性實驗,以及方法學驗證等大量研究工作,要求巨大的人力、物力、財力投入,但預期結果的不確定性極高。相對而言,體外效力檢驗方法不涉及標準嚴苛的檢驗用動物以及繁冗復雜的免疫和/或攻毒操作、觀察、取樣及檢測,影響變量更少、可控性更高、檢驗成本更低且符合3R原則。在眾多PCV2疫苗中,體外效力檢驗相對效力法通常作為效力檢驗的“二選其一”之方法,但各產品的“專屬”方法仍然各異,若能夠開發研制通用參考疫苗及配套檢驗用抗體和試劑,統一“度量用尺”,進而制定各個疫苗的相對效力合格限值,可有望間接實現疫苗效力的統一評價;而體外效力檢驗抗原含量測定法也有望成為直接實現疫苗效力統一評價的潛在方法,通過制備標準抗原,不論使用ELISA還是色譜技術,均可以實現抗原含量的精準測定,但是,如何通過科學合理的前處理,最大程度保留不同成品疫苗中的抗原,以滿足體外效力檢驗上樣要求,需開展大量的交叉學科探索研究,這是監管機構與生產企業攜手共進、雙向奔赴之方向。