血凝試驗(yàn)和反向間接血凝試驗(yàn)定量檢測(cè)PCV2 Cap抗原的研究

李晶梅,謝紅玲,薛 霜,李文靜,黃 濤,王煥君,劉項(xiàng)羽,張飛雁,朱 薇,李婷婷,石寶蘭

(國藥集團(tuán)動(dòng)物保健股份有限公司,武漢 430075)

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬。病毒粒子直徑15-20 nm,呈20面體對(duì)稱結(jié)構(gòu),無囊膜。PCV2病毒主要包括2個(gè)開放的閱讀框架(ORF1和ORF2),其中ORF2編碼的病毒衣殼蛋白(Capsid protein,Cap)是PCV2的主要的結(jié)構(gòu)蛋白、免疫原性蛋白。表達(dá)PCV2 Cap蛋白的重組桿狀病毒接種昆蟲細(xì)胞,培養(yǎng)數(shù)日后可獲得含有PCV2病毒樣顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)液,即PCV2 Cap抗原,此抗原可制備PCV2疫苗。疫苗生產(chǎn)中需要定量檢測(cè)PCV2 Cap抗原,常用方法有SDS-PAGE、ELISA和BCA定量,其中SDS-PAGE和ELISA方法耗時(shí)較長(zhǎng),BCA只能檢測(cè)純化后樣品。

很多病毒具有凝集紅細(xì)胞的特性,如新城疫病毒可凝集雞、小鼠和豚鼠等的紅細(xì)胞[1],豬細(xì)小病毒可凝集豚鼠、雞和大鼠等的紅細(xì)胞[2],犬細(xì)小病毒可凝集豬紅細(xì)胞[3],乙腦病毒可凝集鵝紅細(xì)胞[4]等。反向間接血凝試驗(yàn)(RIHA)是用已知抗體致敏紅細(xì)胞,然后與樣品在適宜條件下反應(yīng),如樣品中含有目的抗原,則抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合,紅細(xì)胞出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象[5]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)重組桿狀病毒表達(dá)的PCV2 Cap抗原凝集豬、雞、綿羊紅細(xì)胞的特性進(jìn)行了初步研究,并嘗試用反向間接血凝方法定量檢測(cè)PCV2 Cap抗原,以期建立簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)的PCV2 Cap抗原定量檢測(cè)方法。

1 材料和方法

1.1 抗原、病毒、單抗 昆蟲細(xì)胞重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的PCV2 Cap抗原,昆蟲細(xì)胞擴(kuò)繁的空桿狀病毒,豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬傳染性胃腸炎病毒(PEDV)、豬流行性腹瀉病毒(TGEV),PCV2 Cap單抗,均由國藥集團(tuán)動(dòng)物保健股份有限公司保存。

1.2 主要試劑耗材 1%豬紅細(xì)胞、1%醛化豬紅細(xì)胞、1%雞紅細(xì)胞、1%醛化雞紅細(xì)胞,1%醛化綿羊紅細(xì)胞,1%鞣化綿羊紅細(xì)胞,PBS(0.1 mol/L,pH 7.2)、含1%兔血清的PBS、醋酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH 5.0)均為常規(guī)方法配制。

1.3 PCV2 Cap抗原的血凝特性研究 按《中國獸藥典》[6]中的血凝試驗(yàn)操作方法,用PBS和含1%兔血清的PBS分別作為稀釋液,用1%豬紅細(xì)胞、1%醛化豬紅細(xì)胞、1%雞紅細(xì)胞、1%醛化雞紅細(xì)胞、1%醛化綿羊紅細(xì)胞、1%鞣化綿羊紅細(xì)胞分別測(cè)定PCV2 Cap抗原和空桿狀病毒的血凝效價(jià)。

1.4 反向間接血凝試驗(yàn)最優(yōu)單抗致敏稀釋度的確定

1.4.1 1%致敏紅細(xì)胞的制備 用醋酸鹽緩沖液稀釋PCV2 Cap單抗,使稀釋倍數(shù)分別為1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000。再分別與1%鞣化綿羊紅細(xì)胞等體積混合,37 ℃水浴30 min致敏。用含1%兔血清的PBS洗紅細(xì)胞并重懸,獲得不同稀釋度單抗致敏的1%致敏紅細(xì)胞。

1.4.2 抗原的準(zhǔn)備 用PBS按1∶100稀釋PCV2 Cap抗原備用,簡(jiǎn)稱Cap抗原。

1.4.3 最優(yōu)單抗致敏稀釋度的確定 RIHA效價(jià)測(cè)定的具體操作為:1)在96孔血凝板各孔加入0.025 mL含1%兔血清的PBS;2)各行第1孔加入0.025 mL Cap抗原,倍比稀釋至11孔,棄去0.025 mL;3)各行每孔分別加入0.025 mL 1.4.1項(xiàng)制備的不同稀釋度單抗致敏的1%致敏紅細(xì)胞;4)振蕩混勻,靜置90～120 min,當(dāng)?shù)?2孔(陰性對(duì)照)孔底紅細(xì)胞出現(xiàn)鈕扣狀沉積時(shí)判定結(jié)果,以使致敏紅細(xì)胞50%凝集的樣品的最高稀釋度為該樣品的RIHA效價(jià)。如此,用不同稀釋度的單抗致敏的1%致敏紅細(xì)胞分別測(cè)定Cap抗原RIHA效價(jià),效價(jià)最高的1%致敏紅細(xì)胞對(duì)應(yīng)的單抗的最高稀釋度為本批次單抗的最適致敏稀釋度。

1.5 反向間接血凝試驗(yàn)的特異性、敏感性研究

1.5.1 1%致敏紅細(xì)胞的制備 以1.4.3確定的最適稀釋度稀釋單抗,稀釋后的單抗與1%鞣化綿羊紅細(xì)胞等體積混合,37 ℃水浴30 min致敏,獲得1%致敏紅細(xì)胞,備用。

1.5.2 RIHA方法的敏感性、特異性 用1%致敏紅細(xì)胞、1%鞣化紅細(xì)胞分別測(cè)定被檢樣品的血凝效價(jià),被檢樣品包括濃縮純化后的PCV2 Cap抗原、未經(jīng)純化的PCV2 Cap抗原、空桿狀病毒、PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、PEDV和TGEV。

1.5.3 RIHA方法的應(yīng)用 用1%致敏紅細(xì)胞測(cè)定若干未經(jīng)純化的和濃縮純化后的PCV2 Cap抗原的RIHA效價(jià),與ELISA測(cè)定的含量結(jié)果進(jìn)行比較,研究方法的敏感性、實(shí)用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV2 Cap抗原的血凝特性 HA效價(jià)結(jié)果詳見表1。純化和未純化的PCV2 Cap抗原均可凝集豬、雞、綿羊紅細(xì)胞,空桿狀病毒不凝集紅細(xì)胞,說明是PCV2 Cap抗原凝集了紅細(xì)胞。含量相近的純化和未純化的PCV2 Cap抗原,分別用不同紅細(xì)胞、不同稀釋液檢測(cè),HA效價(jià)各有高低,說明有些紅細(xì)胞和稀釋液的組合不能準(zhǔn)確定量PCV2 Cap抗原。同一PCV2 Cap抗原用醛化紅細(xì)胞和新鮮紅細(xì)胞測(cè)得的HA效價(jià)不完全相同,說明醛化導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集特性發(fā)生了變化。使用相同紅細(xì)胞檢測(cè)相同樣品,而稀釋液不同時(shí),測(cè)得的HA效價(jià)不完全相同,說明稀釋液對(duì)HA效價(jià)有顯著影響。豬紅細(xì)胞測(cè)得的HA效價(jià)高于雞紅細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞測(cè)得的HA效價(jià),分析原因可能是因?yàn)镻CV2是豬的病毒,所以對(duì)豬紅細(xì)胞較敏感。另外,PCV2 Cap抗原易引起豬紅細(xì)胞的超凝集,雞、羊紅細(xì)胞無此現(xiàn)象(圖1)。

A、B:純化的PCV2 Cap抗原、未純化的PCV2 Cap抗原A / B: Purified PCV2 Cap antigen/Unpurified PCV2 Cap antigen圖1 不同紅細(xì)胞和稀釋液檢測(cè)的血凝結(jié)果圖Fig 1 HA Tested by different erythrocytes and different dilutions

表1 HA效價(jià)(log2)Tab 1 HA titers(log2)

2.2 最適抗體致敏濃度 1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000稀釋的單抗致敏紅細(xì)胞,檢測(cè)PCV2 Cap抗原,效價(jià)分別為7 log2、7 log2、7 log2、6 log2、3 log2、1 log2(表2),由此確定本批次單抗1∶2000稀釋使用最優(yōu)。

表2 不同稀釋度抗體致敏紅細(xì)胞檢測(cè)PCV2 Cap抗原Tab 2 PCV2 Cap Antigen Tested by Antibody Sensitized Erythrocytes with Different Dilutions

2.3 RIHA方法的敏感性、特異性結(jié)果 1%致敏紅細(xì)胞檢測(cè)純化和未純化的PCV2 Cap抗原效價(jià)分別為14 log2、13 log2,高于豬、雞、非致敏綿羊紅細(xì)胞檢測(cè)的HA效價(jià),說明RIHA方法敏感性良好。檢測(cè)PK15細(xì)胞擴(kuò)繁的PCV2病毒液效價(jià)小于1 log2,說明PCV2的含量低于RIHA方法檢測(cè)下限。檢測(cè)空桿狀病毒、CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、TGEV等病毒,效價(jià)均小于1 log2,說明RIHA方法特異性良好。PCV2 Cap抗原對(duì)1%鞣化紅細(xì)胞也有凝集,但凝集效價(jià)遠(yuǎn)低于1%致敏紅細(xì)胞的效價(jià),說明測(cè)得的RIHA效價(jià)是特異的。結(jié)果詳見表3。

2.4 RIHA方法的應(yīng)用 樣品1～樣品4、樣品5～樣品8分別為未純化的、濃縮純化的PCV2 Cap抗原,均1∶500稀釋后檢測(cè)RIHA效價(jià),結(jié)果顯示,RIHA效價(jià)與ELISA方法測(cè)得的結(jié)果有平行關(guān)系。詳見表4。

表4 樣品檢測(cè)結(jié)果Tab 4 Titer of samples

3 討論與結(jié)論

3.1 PCV2 Cap抗原對(duì)豬、雞、綿羊紅細(xì)胞的凝集特性 PCV1不能凝集動(dòng)物紅細(xì)胞[7],也未見PCV2凝集動(dòng)物紅細(xì)胞的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)用昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備的PCV2 Cap抗原可凝集醛化豬紅細(xì)胞、新鮮豬紅細(xì)胞、醛化雞紅細(xì)胞、新鮮雞紅細(xì)胞、醛化綿羊紅細(xì)胞、鞣化綿羊紅細(xì)胞。上述紅細(xì)胞不凝集PK15細(xì)胞擴(kuò)繁的PCV2全病毒,分析原因可能哺乳動(dòng)物細(xì)胞擴(kuò)繁的PCV2抗原液中PCV2含量少,未達(dá)到能夠凝集紅細(xì)胞的量;昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)體系制備的PCV2 Cap抗原中PCV2 Cap含量高,稀釋后仍可凝集紅細(xì)胞。另外發(fā)現(xiàn)PCV2 Cap抗原易引起豬紅細(xì)胞的超凝集,雞、羊紅細(xì)胞無此現(xiàn)象。

3.2 PCV2 Cap抗原凝集紅細(xì)胞的條件、效價(jià) ELISA定量檢測(cè)為50 μg/mL的純化的PCV2 Cap抗原和47 μg/mL未純化的PCV2 Cap抗原,用不同紅細(xì)胞和不同稀釋液測(cè)得的凝集效價(jià)分別為3 log2～9 log2、2 log2～10 log2。說明紅細(xì)胞不同、稀釋液不同,測(cè)得的PCV2 Cap抗原凝集效價(jià)不同,且差異較大。

3.3 定量檢測(cè)PCV2 Cap抗原的RIHA方法 PCV2 Cap單抗致敏鞣化綿羊紅細(xì)胞,獲得1%致敏紅細(xì)胞,可用于RIHA方法定量檢測(cè)PCV2 Cap抗原。1%致敏紅細(xì)胞檢測(cè)某批次純化和未純化的PCV2 Cap抗原,效價(jià)分別為14 log2、13 log2,均高于豬、雞、非致敏綿羊紅細(xì)胞檢測(cè)的HA效價(jià),說明RIHA方法敏感性良好。空桿狀病毒、PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、TGEV的RIHA效價(jià)均小于1 log2,說明該方法特異性好,同時(shí)說明哺乳動(dòng)物細(xì)胞擴(kuò)繁的PCV2含量低未到達(dá)RIHA方法的檢測(cè)下限。純化后和未純化的PCV2 Cap抗原的RIHA效價(jià)均與ELISA定量檢測(cè)結(jié)果有平行關(guān)系,并且RIHA方法使用的設(shè)備耗材少、操作簡(jiǎn)便、用時(shí)短(1.5～2 h),可在抗原的生產(chǎn)環(huán)節(jié)應(yīng)用作為SDS-PAGE和ELISA方法的補(bǔ)充。如檢測(cè)生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的抗原可判定含量是否達(dá)標(biāo)并結(jié)束培養(yǎng);檢測(cè)純化濃縮后的抗原和廢液可判定純化濃縮工藝的抗原損耗率。

綜上,通過研究 PCV2 Cap對(duì)豬、雞、綿羊紅細(xì)胞的凝集特性,確定了血凝方法定量檢測(cè)PCV2 Cap有可行性,該方法的穩(wěn)定性、與其他定量方法是否有平行關(guān)系等尚需進(jìn)一步研究;本研究通過用PCV2 Cap單抗致敏紅細(xì)胞初步建立了定量檢測(cè)PCV2 Cap抗原的RIHA方法,確定其敏感性、特異性良好,RIHA效價(jià)與ELISA定量檢測(cè)結(jié)果有平行關(guān)系,可用于昆蟲細(xì)胞重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的PCV2 Cap抗原的快速定量檢測(cè)。