清熱生肌膏介導NLRP3對放射性皮炎大鼠MPO、Hyp表達的影響*

楊文博 孫云川 楊洪娟 杜強 徐旭英

(1.河北省滄州中西醫結合醫院,河北 滄州 061000;2.首都醫科大學附屬北京中醫院,北京 100000)

放療是腫瘤的主要治療方法,雖然其對腫瘤的治療效果顯著,但放射線在治療的同時還會損傷正常組織,引發放射性皮炎[1]。中醫認為,放射線為火熱毒邪,在對放射性皮炎的治療中應以清熱解毒為主,從而達到治療創傷皮膚的目的[2]。中醫對該病采用清熱解毒、益氣理脾等原則進行治療[3],清熱生肌膏具有清熱解毒、活血化瘀等作用,該藥已被證實對于治療燙傷具有顯著作用[4]。炎性反應是機體在受到刺激后的保護性免疫反應,炎性反應能力降低會導致機體受到感染,過高則會增加機體的炎癥,最終引發炎癥性疾病產生。冰原會激活炎性小體,而關于核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)的研究是炎性小體中研究最為深入的。NLRP3參與多種炎癥疾病的始末,如腫瘤、炎癥性腸病等。研究證實NLRP3及其下游因子在多發性肌炎和皮肌炎中發揮重要作用,并與輔助性T細胞亞群聯系密切,一定程度上可誘導這些疾病的發展[5]。髓過氧化酶(Myeloperoxidase,MPO)可反應中性粒細胞的數目與活性,是評價炎癥程度的指標。羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)主要定位于皮膚、結締組織,可反映膠原蛋白的含量,其水平高低可反映膠原的合成能力,在皮膚愈合的過程中,可反應創面修復程度。目前MPO、Hyp在燙傷中的作用已有研究證實[6-7],但關于兩者在放射性皮炎中的文獻較少,具體作用尚未完全掌握。因此文本研究清熱生肌膏介導NLRP3炎性小體對放射性皮炎大鼠皮膚損傷修復及MPO、Hyp表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取SD健康大鼠90只,由長沙市天勤公司提供[生產許可證號：SCXK(湘)-2019-0025],體質量在200～300 g之間,鼠齡在6～8周,常規飼養,自由飲食飲水。本研究經醫院動物倫理委員會批準(批號：20190203)。

1.2 主要實驗試劑與儀器 清熱生肌膏(汕頭市美寶制藥有限公司,批號1312403A),二甲基苯蒽(上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司,貨號：D3254-100MG),復方茶多酚軟膏(大連市皮膚病醫院藥劑科研制),透射電鏡(蘇州沃弗本精密機械公司,型號：蔡司Xradia Context microCT);蘇木素-伊紅(廈門海菲生物公司);裂解液(北京普利萊基因技術公司);勻漿機(上海坤誠科學儀器公司);MPO、Hyp試劑盒(合肥萊爾生物公司);NLRP3、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate-specific proteinase-3,Caspase-1)一抗(深圳豪地華拓生物公司)、山羊抗兔二抗(北京全式生物公司)。

1.3 藥物 清熱生肌膏組成：金銀花20 g,連翹20 g,蒲公英20 g,生黃芪20 g,玄參20 g,當歸15 g,冰片10 g。

1.4 乳腺癌模型建立及放射性皮炎模型建立 參照文獻[8]建立放射性皮炎模型,將大鼠固定后,暴露左下肢,其余部位遮蔽,采用軍事醫學科學院60Co源照射,30 Gy γ 射線一次照射,照射劑量率0.68 Gy/min,照射距離2 m,照射時間12 min 2 s。按國際抗癌聯盟急性放射反應評分標準[9],30只大鼠造模成功。

1.5 分組及干預 取80只大鼠隨機分為正常組、模型組、治療組、對照組,每組20只。除正常組外均建立放射性皮炎大鼠模型。正常組與模型組大鼠常規飼養;治療組：大鼠于傷口處均勻涂抹清熱生肌膏,2次/d;對照組：大鼠于傷口處均勻涂抹復方茶多酚軟膏,2次/d。各給藥組均持續給藥3周[10]。剩余10只大鼠另設抑制劑組：取10只大鼠建立放射性皮炎模型,建模成功24 h后于尾靜脈注射NLRP3抑制劑(MCC950,10 mg·kg-1),用以蛋白印跡實驗。輻射傷后1、3、7、14、21 d[10]各組分別處死兩只大鼠,剩余大鼠于治療結束后立即處死用于后續實驗。

1.6 檢測指標

1.6.1 創面愈合測定 輻射傷后1、3、7、14、21 d各組分別處死兩只大鼠。將創面描記在紙上,后用圖像分析儀測定面積。創面愈合率=(開始照射面面積-未愈合創面面積)/開始照射面面積。

1.6.2 透射電鏡觀察創面組織細胞超微結構 取各組大鼠創面組織(正常組大鼠取正常皮膚組織)切成小塊后放入戊二醛中固定2 h,PBS清洗后固定0.5 h,PBS清洗,梯度脫水,包埋,制成50 nm超薄結構組織,后用投射電鏡觀察。

1.6.3 蘇木素-伊紅( Hematoxylin,HE)染色觀察大鼠創面皮膚組織病理改變 取各組大鼠創面組織(正常組大鼠取正常皮膚組織),石蠟切片,脫蠟、水化,蘇木素浸染 10 min,伊紅復染 5 min,脫水、透明、封片后于光學顯微鏡下觀察拍照,并通過網形目鏡計數炎性細胞數量。

1.6.4 分光光度比色法測定MPO活性 取各組大鼠創面組織(正常組大鼠取正常皮膚組織),裂解液裂解后勻漿機勻漿,在4 ℃、6000 r/min的條件下離心15 min,取上清液,離心15 min,取上清,在460 nm處測定OD值,MPO活性=(測定管OD值-對照管OD值)/11.3×取樣量。

1.6.5 樣本堿水解法檢測Hyp含量 Hyp在氧化劑的作用下所產生的氧化產物與二甲氨基苯甲醛作用呈紫色,根據其呈色的深淺可推算其含量。稱量各組大鼠創面組織(正常組大鼠取正常皮膚組織)放人試管中,加入水解液,混勻,加蓋后95 ℃或者沸水浴水解20min。調pH值至6.0～6.8,加入雙蒸水,混勻,加入適量活性炭,混勻。60 ℃水浴15 min,冷卻后3500 r/min離心10 min,取上清在波長550 nln處測定各管吸光度值。

1.6.6 免疫印跡檢測NLRP3、Caspase-1蛋白表達 取各組大鼠創面組織(正常組大鼠取正常皮膚組織),剪碎,裂解液裂解,勻漿機勻漿,在4 ℃下離心5 min, 12000 r/min,取上清置于-20 ℃保存;根據試劑盒說明對蛋白定量。各組蛋白電泳上樣量30 μg,分離蛋白樣本,轉至PVDF膜,封閉后加NLRP3、Caspase-1一抗孵育過夜(1∶500),次日加入1∶10 000稀釋的山羊抗兔二抗,室溫孵育2 h,PBS清洗10 min 4次,Odyssey V3.0軟件分析,以各目的蛋白條帶與GAPDH條帶的灰度比值作為相對表達水平。

2 結果

2.1 各組大鼠創面愈合比較 各組大鼠在治療后第1 d時的創面愈合比較差異無統計學意義(P>0.05),模型組大鼠在治療3-21 d時的創面愈合均低于治療組及對照組(P<0.05)。治療組與對照組大鼠治療3～21 d時創面愈合比較無差異(P>0.05)。見表1。

表1 創面愈合

2.2 各組大鼠創面組織細胞超微結構 正常組大鼠皮膚組織細胞線粒體呈圓形,結構清晰。模型組線粒體腫脹,呈凋亡細胞改變。與模型組相比,治療組與對照組有所改善,見圖1。

圖1 各組大鼠創面組織細胞超微結構(10000×)

2.3 各組大鼠皮膚病理形態 正常組大鼠真表皮層完整,細胞排列整齊,無壞死,模型組大鼠創面組織可見大量炎性細胞浸潤,表皮層壞死,結構紊亂; 與模型組相比,治療組與對照組明顯改善。見圖2。

圖2 HE染色觀察各組大鼠病理組織形態(100×)

2.4 各組大鼠皮膚創面組織中MPO、Hyp表達比較 與正常組相比,模型組大鼠皮膚創面組織中MPO表達升高、Hyp表達降低(P<0.05)。與模型組相比,治療組模型組大鼠皮膚創面組織中MPO表達降低、Hyp表達升高(P<0.05)。治療組與對照組各指標對比無差異(P>0.05),見表2。

表2 各組大鼠 MPO、Hyp表達比較

2.5 各組大鼠皮膚創面組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達 與正常組相比,模型組NLRP3、Caspase-1蛋白表達升高(P<0.05)。與模型組相比,治療組大鼠皮膚創面組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達降低(P<0.05)。治療組與抑制劑組大鼠皮膚創面組織中NLRP3、Caspase-1蛋白對比無差異(P>0.05)。見表3、圖3。

圖3 各組NLRP3、Caspase-1蛋白表達對比

表3 NLRP3、Caspase-1蛋白表達

3 討論

NLRs是機體免疫細胞的主要模式識別受體(Patho- gen recognition receptor,PRRs)之一。損傷相關分子激活NLRs后,通過炎性反應維持免疫耐受等。在NLRs家族中,NLRP3的研究較為深入。NLRP3由胞漿內多種蛋白組成,含有凋亡相關微粒蛋白等[11]。Caspase-1在炎性反應中發揮著重要作用,同時還具有介導細胞焦亡的作用。NLRP3炎癥小體是由其受體蛋白及Caspase-1等組成。NLRP3在被激活后可通過ASC與Caspase-1連接,組成NLRP3炎癥小體,激活Caspase-1增加炎性因子并分泌到胞外,從而參與炎癥反應[12]。有研究表明,NLRP3/Caspase-1通路在皮肌炎中發揮促炎癥作用,基于此本實驗認為抑制NLRP3表達可降低放射性皮炎的炎癥反應,促進創面愈合的作用[13]。清熱生肌膏中金銀花、連翹、蒲公英、玄參具有清熱解毒、疏散風熱、消腫散結的功效;生黃芪、冰片具有清熱解毒、抗菌生肌的功效;當歸補血活血,調經止痛的功效。本研究運用NLRP3抑制劑作為對照組,證實清熱生肌膏具有抑制NLRP3表達,減少炎癥的作用。實驗結果顯示,NLRP3、Caspase-1在模型組中的表達顯著高于健康組,在經過清熱生肌膏的干預后,NLRP3、Caspase-1水平顯著下降,且與NLRP3抑制劑組較為接近。NLRP3抑制劑可有效抑制NLRP3及Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達[14],提示清熱生肌膏也可抑制NLRP3的表達,從而降低炎癥反應。目前已有研究證實復方茶多酚軟膏對與放射性皮炎具有一定的治療效果,因此文實驗運用該藥多為藥物對照,進一步證實清熱生肌膏具有促進創面愈合的作用[15]。實驗結果顯示,給藥第3、7、14、21 d時,治療組大鼠皮膚愈合率均顯著高于模型組且與對照組無差異,提示清熱生肌膏具有促進創面愈合的作用。皮膚組織中細胞的生成及結構變化可反應愈合情況,投射電鏡可有效觀察細胞的變化。本實驗HE染色結果證實了給予清熱生肌膏后可有效改善創面皮膚組織病理損傷情況。經電鏡觀察發現,模型組細胞核染色質濃聚,線粒體腫脹,呈凋亡細胞改變;與模型組相比,治療組與對照組有所改善。提示清熱生肌膏能夠改善放射性皮炎大鼠病理形態,減少炎性細胞浸潤以及皮膚組織細胞凋亡。因此,本研究推測,清熱生肌膏可能是通過抑制NLRP3水平,抑制炎癥反應,改善病變組織病理形態,促進創面愈合。

MPO具有有效的促氧化和炎癥的性質,是評價炎癥嚴重程度的指標之一,其水平的高低可有效監測炎性反應情況,對于本病的治理具有重要作用[16-18]。研究顯示[19],MPO在特應性皮炎中為高表達,抑制其表達后,可抑制中性粒細胞浸潤,減輕Hyp是膠原蛋白所特有的氨基酸,約占其氨基酸總量的13%,Hyp的含量反映膠原在創面中的含量,從而評估創面愈合情況。目前已有研究顯示[20],Hyp在細菌感染皮炎中為低表達,提高其表達后,可促進膠原合成,促進創面愈合。本實驗結果顯示,與健康大鼠相比,模型大鼠體內MPO升高、Hyp降低,在經過清熱生肌膏干預后,MPO降低,Hyp升高。研究顯示,在不穩定型心絞痛患者體內,MPO及oxHDL可能通過調節NLRP3的表達,促使THP-1單核細胞產生IL-1β[21]。本文研究推測,清熱生肌膏通過抑制NLRP3水平,促進Hyp水平、抑制MPO表達,減少炎癥產生,促進膠原合成,較快創面愈合。

4 結論

清熱生肌膏可抑制MPO水平并促進Hyp表達,對放射性皮炎大鼠皮膚損傷修復有積極促進作用,其作用機制可能與介導NLRP3炎性小體有關。