免疫指標在結核性胸腔積液診斷中的研究進展

譚慧 綜述 王璞 審校

(重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科,重慶 400016)

結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的結核病是威脅人類生命健康的全球公共衛生問題之一?！?021年全球結核病報告》[1]指出,2020年全球范圍內估算有990萬結核病新發病例,死亡約151.4萬例,是當下僅次于新型冠狀病毒肺炎的第二大單一傳染病致死原因[2-3]。按最新的診斷分類,結核性胸腔積液(Tuberculous pleural effusion,TPE)歸屬于肺結核[4],發病率約占所有結核病患者3%～30%[5]。TPE是MTB抗原引起的T淋巴細胞介導的胸膜腔內滲出性遲發型超敏反應和胸膜感染共同作用的結果[6-7], MTB抗原通過胸膜下實質病灶的破裂進入胸膜腔,誘發炎癥反應導致毛細血管通透性增加、胸腔積液形成;可能是MTB原發感染的一種表現,也可能與結核病再激活有關。在病變部位,活化的淋巴細胞聚集呈現“區室化”, 各種T細胞通過分泌細胞因子相互作用,形成特殊的感染灶微環境;強烈的免疫反應對MTB有效抑制及清除,故而滲出液的細菌載量少、培養陽性率低,使得從細菌學角度鑒別TPE與其他胸腔積液,尤其是惡性胸腔積液(Malignant pleural effusion,MPE)在臨床上相對延遲且具有挑戰性;從病理學角度,即使內科胸腔鏡的安全性和有效性已得到證實,但高度依賴于操作員專業技術和精密設備,在基層醫院開展受限,因有創性往往不被患者接受。近年來,國內外對于診斷TPE的生物標志物的研究眾多,腺苷脫氨酶(Adenosine deaminase, ADA)在TPE診斷方面的應用價值得到大眾認可、已在臨床實踐中廣泛開展。本文主要就近年來新興的免疫指標在TPE診斷及鑒別診斷的研究進展予以綜述,旨在為臨床早期識別TPE以及今后相關研究提供參考。

1 免疫指標用于TPE的診斷研究進展

免疫指標按來源分為細胞因子、固有免疫、體液免疫指標,其中細胞因子主要包括干擾素、白介素、趨化因子,通過運用免疫病原微生物實驗檢測方法,檢測TPE中上述目標免疫物質,從而達到早期臨床識別TPE的目標。

1.1 細胞因子

1.1.1 干擾素γ(Interferon-γ,IFN-γ) 主要由活化的CD4+ T細胞和自然殺傷細胞釋放,機體感染MTB后,IFN-γ能使巨噬細胞聚集且增加其對MTB的殺菌活性,控制感染播散[8];另一方面,它又能通過程序性死亡分子1(PD1)及其配體(PD-L1)通路抑制CD4+T細胞增殖及黏附活性,使MTB不易被清除[9],在發揮TPE患者中發揮殺菌作用時具有正向和反向雙重作用。國內外學者肯定了非刺激性IFN-γ對TPE的診斷性能：Aggarwal等[10]一項Meta分析顯示, IFN-γ診斷TPE的敏感性93%,特異性96%,PLR 22.80,NLR 0.07,隨后在后續進行的另一項Meta分析中比較了IFN-γ、ADA對TPE診斷準確性,結果表明IFN-γ在確診和排除TPE方面均優于ADA[11]。一些學者也探討了IFN-γ和ADA的聯合診斷價值,提出當在兩者均為陰性,在中、高度疾病流行情況下可用于排除TPE;若均為陽性,對于微生物學未確診的患者,可啟動ATT[12]。IFN-γ是淋巴細胞來源的生物標志物,因此也受TPE不同的感染背景的影響。在TPE患病率較低時,PPV相當低;但IFN-γ在任何流行情況下的NPV均優于ADA：當TPE流行率為5%、25%和85%時,ADA的NPV分別為99.6%、97.6%和76.0%,IFN-γ的NPV分別為99.8%、98.8%和83.0%[13]。雖然IFN-γ比 ADA似乎更具優勢,但從成本效益出發分析,IFN-γ檢測成本高、量化技術繁瑣; INF-γ超靈敏快速免疫懸浮法(IRSA-TB)比ADA似乎擁有更好的成本效益[14-15],但現階段暫未在臨床實驗室廣泛開展。

1.1.2 γ干擾素釋放試驗(Interferon-γ release assays,IGRA)通過量化MTB基因組差異區域(RD)-1編碼的特定抗原[包括早期分泌抗原靶6(ESAT-6)、培養濾液蛋白10(CFP-10)和TB7.7(p4)]刺激離體的效應T淋巴細胞釋放的IFN-γ,判斷是否存在MTB特異性細胞免疫反應[16]。包括酶聯免疫斑點檢測法T-SPOT.TB 和酶聯免疫吸附測定QuantiFERON-TB Gold(QFT), 是世界衛生組織(WHO) 批準用于潛伏性結核病診斷的兩種較成熟的檢測方法[17]。 QuantiFERON檢測MTB特異抗原(ESAT-6、CFP-10和TB7.7)刺激產生的IFN-γ濃度;T-SPOT.TB則檢測外周血中受ESAT-6和CFP-10刺激釋放的IFN-γ的T細胞,對其進行斑點計數。與PPD相比,ESAT-6和CFP-10不存在于絕大部分非結核桿菌(NTM)和卡介苗(BCG)中,可避免BCG接種和NTM感染帶來的假陽性[18]。T-SPOT.TB的診斷性能優于QuantiFERON[19],目前在臨床實踐中,應用外周血T-SOPT.TB篩查結核感染開展較為廣泛,尤其是對于使用免疫抑制劑、生物制劑或小分子靶向藥物的患者,在啟動上述治療方案初期,需密切隨訪監測A、B斑點數變化,避免在治療期間出現繼發結核感染或潛伏結核活動。由于MTB抗原特異性淋巴細胞的“區室化”特性,多項研究提出胸水T-SPOT.TB診斷效能優于外周血[20-22];但在臨床實驗室,T-SOPT.TB應用于胸水標本仍比外周血標本少見,可能與胸腹腔積液、腦脊液等臨床樣本缺乏統一的操作流程和判斷標準有關。

1.1.3 白細胞介素27(Interleukin27,IL-27) 白細胞介素可與特定受體結合介導白細胞間的通訊,進而促進各種類型的炎癥反應。研究發現一些白介素在TPE中升高,促使學者探索它們在診斷TPE及鑒別TPE 與其他類型胸腔積液方面的潛在價值。IL-27是一個值得關注的指標,它是一種主要由活化的抗原遞呈細胞所分泌的異二聚體,屬于IL-12/IL-6細胞因子家族成員,作為MTB感染人體后免疫應答中重要的細胞因子,通過Th1免疫反應參與 IFN-γ 的產生,對Th1型免疫和IFN-γ分泌存在雙重調節作用[23]。許多研究均報告了胸水 IL-27對于TPE的診斷是一種敏感而特異的生物標志物：有3項Meta分析全面評估了IL-27對TPE的診斷效率,分別納入9項(1 226例患者)、7項(1 157例患者)、11項(1 454例患者)研究,其敏感性為92%～95%、特異性為90%～92%、PLR 為13.99～29.87、NLR 為0.07～0.09[24-26]。IL-27在鑒別TPE和惡性胸膜間皮瘤、淋巴瘤所致的胸腔積液不盡如人意[27],在小兒TPE中的診斷價值亦有限,無法區分兒童TPE和肺炎支原體肺炎性胸腔積液[28]。但學者們一致認為IL-27聯合IFN-γ或ADA,或者3者聯合檢測可提高診斷效率(當3項至少有一項為陽性時,最佳靈敏度為100%;當3項都呈陽性時,特異性為100%)[29],可作為臨床診斷TPE的優選策略。另外,Jiang等[30]探討了年齡作為獨立協變量對胸水ADA、IFN-γ和IL-27在TPE診斷方面的影響,在年輕患者(≥18歲、≤40歲)中, ADA的診斷性能最優;對于40歲以上患者,IL-27和IFN-γ在區分TPE與非TPE表現更出色,故建議在臨床上將生物標記物與年齡相結合,以較高的敏感性和特異性估計TPE的發生概率,可能使患者避免侵入性操作。但IL-27檢測支出大、技術繁瑣,如何降低檢測成本、簡化檢測程序可作為未來研究探索的空間。

1.1.4 其他白介素 一些研究發現胸水IL-32、IL-33、IL-2、可溶性IL-2受體(sIL-2R)、IL-31在TPE中表達亦增高,對TPE診斷有潛在價值[31-35],但它們的臨床相關性及診斷準確性需進一步確定,且與ADA、IFN-γ以及IL-27相比,無明顯優勢。

1.2 趨化因子 趨化因子CXCR3配體,由IFN-γ誘導,強烈募集免疫細胞,與結核病發病相關;包括3種趨化因子(CXCL9、CXCL10和CXCL11)。CXCL10,又名IFN-γ的誘導蛋白10(IP-10),在結核病患者的血液和體液中得到了最廣泛的檢測;連續的血漿IP-10檢測可能有利于區分來自LTBI的活動性結核[36]。Porcel等[37]評估了胸水IP-10濃度識別TPE的靈敏度和特異性,分別為84%和90%,與IFN-γ一樣,它的預測值不受年齡影響。Chung等[38]研究評價了胸水CXCL9、CXCL11對TPE的診斷價值,發現它們在TPE組濃度顯著高于非TPE組(MPE、PPE、漏出液),AUC均>0.9,其中CXCL9在區分TPE與MPE中表現最佳。趨化因子在TPE診斷中的潛在作用值得關注,現階段涉及文獻較少,其適用性、穩定性、檢測技術和成本,以及免疫狀態是否會影響結果,這些問題需要在未來多中心研究中解答。

1.3 其他免疫學相關指標 單核-巨噬細胞對于宿主免疫MTB感染至關重要,在不同因素刺激下,可通過經典激活或替代激活途徑極化為“促炎”型M1細胞(CD14+CD86+)、“抑炎”型M2細胞(CD14+CD163+)。一項前瞻性研究比較了TPE和MPE胸水M1/M2型細胞數量、占比,發現TPE中巨噬細胞向M1極化,MPE向M2極化,提出可通過胸水巨噬細胞的極化方向對兩者進行辨別[39]。程序性死亡分子-1配體(PD-L1)及其可溶性形式(sPD-L1)是近年來免疫微環境研究的熱點,抗PD1/PD-L1抗體已在腫瘤的靶向免疫治療取得巨大突破。PD-1/PD-L1通路在抗結核免疫中主要發揮負性調節作用,抑制T細胞活化,從而阻止過度免疫損傷;動物試驗證實敲除PD-1、PD-L1后,小鼠肺部病理變化加重,MTB負荷升高[40]。有研究提出TPE胸水中sPD-L1明顯高于MPE或非TPE;對TPE的診斷有一定輔助價值(AUC>0.8)[41-42]。PD-L1為TPE的診斷研究提供了新的方向,其在TPE中的具體機制以及診斷準確性尚不明確,現階段在腫瘤的免疫向治療領域應用更為廣泛,PD-1抗體特異性與T淋巴細胞表面的PD-1結合或PD-L1抗體與腫瘤細胞的PD-L1結合,從而解除腫瘤細胞對淋巴細胞的免疫抑制調節,達到殺滅腫瘤細胞的目的。

2 新的技術方法在TPE的診斷研究進展

隨著人類基因組的解碼和基因檢測技術的日益成熟,高通量測序技術被廣泛應用于臨床醫學,為研究者中在體液或胸膜組織中探索能夠有效診斷TPE的新型生物標志物創造了一種新的機遇;學者們也利用高通量測序方法探討與結核病相關的RNA、蛋白質和小分子代謝物質,涉及轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學。

2.1 轉錄組學-miRNA 一類小型非編碼RNA,不僅存在于細胞中,也存在于各種體液中,具有良好穩定性且易于檢測,可通過實時熒光定量PCR技術完成胸水中miRNA的定量檢測[44]。miR-29a屬于較早發現的與腫瘤相關的miRNA之一,在肺結核的發病機制中也起重要作用,通過與IFN-α mRNA結合負向調節機體對MTB的免疫應答[45]。有研究發現TPE患者胸水miR-29a的表達明顯高于MPE;且miR-29a與ADA在TPE中呈顯著正相關;在ATT后胸腔積液中miR-29a表達下調,提示miR-29a有望成為鑒別TPE與MPE的新指標,并判定結核病的活動性[46]。但由于尚無基于大樣本的研究對TPE高表達的miRNA進行篩選和驗證、胸水中miRNA濃度偏低、定量檢測技術待優化、對于已篩選的特異性miRNA在TPE中的作用機制仍未知等因素,目前暫未開發商業化的基于miRNA組合物的TPE預測試劑盒。

2.2 蛋白質組學 主要研究生物體內蛋白質含量動態變化,多年來一直是生命科學各個領域的研究熱點。蛋白質組學在結核病研究和臨床應用中具有巨大潛力。基于質譜分析的非標記定量蛋白質組學技術是近年來發現結核病相關蛋白標記的有前途的方法[47],從體液中分析出與非結核性疾病患者之間的差異性蛋白,再通過蛋白質譜的比較分析,尋找到結核性相關特異性蛋白,進而發現TPE新型診斷標志物。補體C1抑制物、銅藍蛋白、溶菌酶前體、凝溶膠蛋白等被發現在TPE中高于MPE[48-51],顯示了區分TPE與MPE的潛在能力。國內學者有兩項研究對比分析了TPE患者血清、胸水蛋白質組,發現TPE患者體液中特異性高表達相對分子質量為2660的蛋白質,提示具有此特征的蛋白可能是診斷TPE的目標蛋白[52-53]。此方面研究受限于諸多因素(如蛋白質樣品的制備處理、技術成本高等),僅停留在描述階段,對初現曙光的目標蛋白也缺乏更深層次研究。

2.3 代謝組學 主要是通過探索生命體在不同生理病理狀態下所產生的內源性小分子代謝物變化規律,尋找疾病的特異性代謝標志物。核磁共振(NMR)光譜和質譜(MS)是代謝分析的兩種主要技術[54]。有研究對TPE、MPE患者胸水小分子的代謝譜進行了比較分析,發現它們間的物質代謝差異顯著：研究在TPE與MPE間篩選出17種差異代謝物,TPE中有5種上調,亞油酸甲酯和替普瑞酮上調62倍、19倍[55]。細胞外囊泡(EV)的代謝組學分析是一個新的研究領域。EV是細胞在機體應激時以脂質雙分子層結構包裹胞漿物質并分泌到細胞外的一種納米級囊泡,其中包含DNA、RNA、蛋白質等成分,具有調節細胞通訊、血管生成、免疫調節作用。Luo等[56]從胸水EV代謝物水平探索了結核和惡性腫瘤的代謝重編程,為胸腔積液的機制提供了新的見解,發現了區分TPE和MPE的4個候選代謝物(苯丙氨酸、亮氨酸、磷脂酰膽堿和鞘磷脂)。對于延遲或漏診的患者,代謝物組分析可能是生化、免疫檢測的有益互補。但它也面臨著蛋白質組學相似的困境,可重復性差,在尿液、血清或胸液中的MTB代謝標志物未確定,今后需開發更快速的檢測方法及方便的EVs分離技術。

3 總結與展望

TPE診斷相關研究所涉及的免疫指標中,IGRA運用最為廣泛,其中以外周血T-SPOT.TB最為顯著,未刺激的IFN-γ、IL-27也是重要的檢測指標,但由于檢測成本高、技術復雜,不作為TPE診斷的常規選擇。在臨床中,對于不同標志物的優勢可聯合應用,使優劣勢互補增強特異度和靈敏度以提高應用價值。其他具有潛在價值的標志物,實驗證據尚不足且差異較大未被廣泛接受。另外,不能提供培養和藥物敏感性信息是免疫指標無法回避的缺陷。隨著醫學科學技術的不斷發展,新興的檢測技術不斷涌現,給疑難危重感染性疾病的診療注入“新力量”。轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學相關研究的引入,為TPE的診斷開拓了新視野,但尚處于“萌芽期”,還有諸多問題待解決。在醫療條件較差的地區,需權衡檢測技術性能與患方經濟可承受性,“因地制宜”規范應用,同時緊密結合經典的結核病微生物學檢查,降低患者疾病負擔。