芹菜素通過AMPK/mTOR通路調控肺癌A549細胞自噬*

雷軒 羅丹 盧梁杰 高露洋 王文軍

(西南醫科大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科,四川 瀘州 646000)

我國肺癌的發病率及死亡率均為惡性腫瘤之首,是癌癥相關死亡的重要原因[1-2]。目前肺癌主要以綜合治療為主,但由于多數患者確診時已為中晚期,喪失手術機會,加之化療藥物毒副作用大,耐藥性嚴重,肺癌的預后仍不盡如人意[3-4],因此迫切需要開發低毒、有效的新型抗腫瘤藥物。近年來,在眾多新型高效低毒的抗癌藥物中,中醫藥受到越來越多的關注。芹菜素(Apigenin ,APG)是一種常見的天然植物黃酮類化合物,具有多種潛在藥理活性,如抗炎、抑制氧化應激、抗腫瘤、誘導凋亡和自噬等[5-7]。已有研究證實芹菜素對肺癌A549細胞增殖、侵襲、遷移有顯著抑制作用,并可促進凋亡[8-9],但芹菜素在肺癌A549細胞自噬過程中的作用及相關機制報道鮮少,因此本項工作擬探討肺癌A549細胞自噬過程中芹菜素所產生的影響,并對其可能的作用機制進行分析,以期為臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 肺癌A549細胞來源于西南醫科大學中心實驗室。芹菜素(規格：每支10 mg,純度：>99%,貨號：HY-N1201),腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)抑制劑Compound C(規格：每支5 mg,純度：>99%,貨號：HY-13418A)均購自美國MCE公司;細胞計數試劑盒購自碧云天生物技術公司;細胞自噬染色檢測試劑盒(MDC法)購自Beyotime;β-Actin抗體購自天德悅公司,P62抗體購自Abcam;微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)抗體、p-AMPKα抗體、AMPKα抗體、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗體、p-mTOR抗體均購自CST公司;胰酶-EDTA、PBS購自吉諾醫藥生物技術有限公司;RIPA總蛋白裂解液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、磷酸化蛋白酶抑制劑、BCA蛋白質濃度測定試劑盒、麗春紅染液、ECL化學發光檢測試劑盒、一抗稀釋液、二抗稀釋液、抗體洗脫液、顯影定影液、脫脂奶粉等均購自ASPEN公司。

1.2 細胞培養及分組 在含10%FBS+1%P/S的F12K培養液中放置人肺癌A549細胞,置于5%CO2加濕培養箱中37 ℃下培養;等待細胞融合至80%時,吸出培養液,用PBS清洗細胞,去除上清,胰酶消化后加入培養液進行傳代培養,收集培養后的細胞進行后續實驗。將A549細胞分為空白對照組(0 μmol/L APG),低、中、高濃度組(20,40,80 μmol/L APG)和抑制劑組(80 μmol/L APG+10 μmol/L AMPK抑制劑Compound C)5組。

1.3 CCK-8法檢測芹菜素對A549細胞增殖的影響 將對數生長期細胞用胰蛋白酶消化后配制成濃度為1×105個/mL的細胞懸液,按10 000個/孔接種于96孔板,每孔加入100 μL,放入5%CO2培養箱中37℃下培養24 h。24 h后分別加入終濃度為0、20、40、80、160 μmol/L的芹菜素培養24、48、72 h,各組均設立6個復孔,加入CCK-8溶液繼續孵育2 h。使用酶標儀測定各孔450 nm吸光度值(A值),以溶劑處理的細胞為對照組,按公式計算藥物對細胞的增殖抑制率。抑制率%=(A值對照組-A值實驗組)/(A值對照組-A值空白組)×100%。計算24、48、72 h的半數抑制濃度(IC50)值。

1.4 MDC染色法檢測芹菜素對A549細胞自噬的影響 各組干預48 h后,根據細胞自噬染色法(MDC法)試劑盒使用說明進行染色,染色后使用熒光顯微鏡(×3000倍)對比觀察,各組隨機選取3個視野進行拍照并計數,檢測到高亮點狀熒光表示自噬小泡,參照文獻[10]計算積分光密度值(IOD)。以上步驟重復3次。

1.5 Western blot檢測自噬及AMPK/mTOR通路相關蛋白表達水平 各組培養48 h后收集細胞,用PBS多次清洗細胞以去除培養液,加入RIPA裂解液裂解細胞,反復搖動培養瓶使細胞充分裂解,提取總蛋白,使用BCA試劑盒檢測樣品蛋白濃度;樣品蛋白經電泳、轉膜后,將膜移至封閉液孵育盒,室溫下封閉1 h。除去殘留封閉液,加入稀釋好的一抗p-AMPKα、AMPKα、p-mTOR、mTOR、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ及P62抗體4℃過夜。孵育結束后,用TBST洗滌3次;將稀釋好的二抗加入,孵育30 min后搖床上TBST洗滌3次。化學發光法顯影、拍照,以β-actin作為內參蛋白,使用AlphaEaseFC軟件分析目標帶的光密度值。以上步驟重復3次。

2 結果

2.1 芹菜素對A549細胞增殖的影響 空白對照組培養24、48、72 h的細胞增殖抑制率比較差異無統計學意義(P>0.05)。與空白對照組比較,芹菜素處理后A549細胞增殖抑制率隨濃度增加呈上升趨勢,呈濃度依賴關系(P<0.05)。20、40、80 μmol/L芹菜素組隨作用時間延長,對A549細胞的增殖抑制效應逐漸增加,呈時間依賴關系(P<0.05)。160 μmol/L芹菜素組培養48及72 h的細胞增殖抑制率明顯高于24 h(P<0.05),但48與72 h之間的細胞增殖抑制率無統計學差異(P>0.05)。見表1、圖1。經SPSS軟件分析芹菜素作用A549細胞24、48、72 h的IC50值分別為128.13、52.18、24.03 μmol/L。

圖1 芹菜素對A549細胞增殖抑制率的影響

表1 芹菜素對A549細胞增殖抑制率的影響

2.2 芹菜素對A549細胞自噬的影響 與空白對照組比較,低、中、高濃度組A549細胞中檢測到具有高亮點狀熒光的自噬小泡數量及IOD值逐漸增加,細胞自噬呈濃度依賴性增加(P<0.01)。抑制劑組與高濃度實驗組比較,細胞中含高亮點狀熒光的自噬小泡及IOD值減少,差異具有統計學意義(P<0.01)。見圖2、3。

圖2 芹菜素對A549細胞自噬的影響(3000×)

圖3 積分光密度值(IOD)比較

2.3 芹菜素對A549細胞中自噬相關蛋白表達的影響 低、中、高濃度組與空白對照組比較,LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達水平依次升高,P62蛋白表達水平依次降低,均呈濃度依賴性(P<0.05)。抑制劑組與高濃度組比較,LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達水平下降,而P62蛋白表達水平升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 芹菜素對A549細胞自噬相關蛋白表達的影響

2.4 芹菜素對A549細胞中AMPK/mTOR通路相關蛋白表達的影響 與空白對照組相比,各濃度芹菜素組p-AMPKα表達水平及p-AMPKα/AMPKα比值隨濃度升高依次增加,而p-mTOR表達水平及p-mTOR/mTOR比值隨濃度升高依次降低,均呈濃度依賴性(均P<0.05)。與高濃度組比較,抑制劑組p-AMPKα蛋白表達水平和p-AMPKα/AMPKα比值下降,而p-mTOR蛋白表達和p-mTOR/mTOR比值升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 芹菜素對A549細胞AMPK/mTOR通路相關蛋白表達的影響

3 討論

芹菜素是一種廣泛分布的天然植物類黃酮,具有多種生理功能及藥理作用[11]。近來,芹菜素因其抗腫瘤活性和低毒性而被廣泛研究[12]。已有研究表明,芹菜素以劑量依賴方式降低人黑色素瘤細胞A375P和A375SM的細胞活力[13]。在肝癌細胞系SMMC-7721和HepG2中,芹菜素以劑量和時間依賴方式表現出顯著抗增殖活性,而對非致瘤細胞系LO2的細胞活力無顯著影響[14]。本研究結果顯示,芹菜素呈濃度依賴性顯著抑制肺癌A549細胞增殖活性,且在20、40、80μmol/L濃度下呈時間依賴性。

自噬是溶酶體介導的細胞自我消化過程,作為Ⅱ型程序性細胞死亡,對腫瘤的發生發展過程具有重要作用[15]。在自噬體形成過程中,自噬標志蛋白微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)被脂質化,LC3Ⅰ轉化為LC3Ⅱ,聚集于自噬體膜,蓄積的LC3Ⅱ被視為自噬標志物[16]。P62是一種多功能支架蛋白,參與各種信號通路的調節及自噬,作為一種重要的適配器,P62通過LIR結構域與核心自噬蛋白質LC3相互作用,介導特定的細胞器和蛋白質聚集體遞送至自噬溶酶體后共同被降解,細胞內P62水平嚴格受自噬活性調控,其表達水平與自噬活性成反比[17-18]。研究顯示,芹菜素可通過促進LC3蛋白的轉化,p62降解及酸性囊泡細胞器的形成顯著增加肝癌HepG2細胞、甲狀腺乳頭狀癌BCPAP細胞中的自噬水平,誘導細胞自噬[19-20]。此外,芹菜素也能通過誘導胃癌AGS細胞、肺鱗癌NCI-H520細胞、結腸癌HCT116細胞自噬和凋亡,抑制腫瘤生長[21-23]。本研究顯示,芹菜素處理A549細胞后,高亮點狀熒光自噬小泡及自噬標志蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ表達水平呈濃度依賴性增加,而P62蛋白表達水平逐漸降低,表明芹菜素可以促進肺癌A549細胞自噬。

AMPK是一種能量傳感器,基本存在于所有真核生物中,由異源三聚體復合物組成,包括α催化亞基和β、γ調節亞基,在代謝紊亂和癌癥中起著關鍵作用[24]。AMPK通路通過磷酸化而活化,活化的AMPK可調節各種代謝過程,包括自噬[25]。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是細胞代謝和自噬的重要調節因子,自噬誘導和mTORC1激活之間存在緊密的反向耦合關系[26]。AMPK/mTOR是細胞中從合成代謝到分解代謝的轉換,是自噬調控的關鍵途徑,通常充當自噬的起始途徑[27]。已有研究證實,芹菜素可激活胃癌細胞中的AMPK通路,促進AMPK磷酸化,并下調p-mTOR來促進自噬性細胞死亡[28]。本研究結果顯示,芹菜素可活化肺癌A549細胞中AMPK/mTOR通路,上調p-AMPKα蛋白表達,增加p-AMPKα/AMPKα比值,并下調p-mTOR蛋白表達及p-mTOR/mTOR比值,促進A549細胞自噬。且在加用AMPK抑制劑Compound C后,逆轉了芹菜素對AMPK通路的激活作用,并抑制了A549細胞自噬水平,進一步證實芹菜素可通過AMPK/mTOR通路誘導A549細胞自噬。

4 結論

本研究表明芹菜素能抑制肺癌A549細胞增殖,誘導其自噬,其作用機制可能與激活AMPK/mTOR通路有關,為芹菜素在肺癌的臨床應用提供了一定參考。但本研究僅為體外細胞實驗,需進一步聯合動物模型和臨床實驗進行探索。