不同稀釋液對苯磺順阿曲庫銨注射液內毒素測定的影響研究

李雪梅,肖斯婷,曹春然（北京市藥品檢驗研究院,國家藥品監督管理局創新藥物安全研究與評價重點實驗室,中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室,北京 102206）

苯磺順阿曲庫銨是一種骨骼肌松弛藥物，用于手術和其他操作以及重癥監護的治療。作為全麻的輔助用藥或在重癥監護病房起肌松作用的藥物，其可以松弛骨骼肌，使氣管插管和機械通氣易于進行[1]。臨床給藥途徑主要有靜脈單次注射和靜脈滴注。對于苯磺順阿曲庫銨注射液的內毒素檢查，是保證其安全使用的前提，有效控制其中內毒素的含量尤為重要[2]。

目前對于苯磺順阿曲庫銨注射液的內毒素檢查多使用凝膠法，查詢相關文獻發現，該品種的內毒素檢查法的研究中，苯磺順阿曲庫銨對內毒素的抑制作用是被公認的，但對于消除該抑制作用的緩沖劑選擇描述卻很模糊。為更準確地測定該品種中細菌內毒素的含量，本文采用動態顯色法對其內毒素進行測定。根據臨床用法用量，將其質量標準中內毒素限值規定為小于3.0EU/mg。為研究苯磺順阿曲庫銨對內毒素的抑制作用，我單位將使用細菌內毒素檢查用水為稀釋劑和使用鎂離子緩沖液稀釋劑的實驗結果進行比對，發現使用細菌內毒素檢查用水作為稀釋劑時，其實驗方法不成立，特此將苯磺順阿曲庫銨注射液可行的內毒素檢查法介紹如下。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 苯磺順阿曲庫銨注射液，規格：5ml:10mg，樣品選擇國產某企業生產，批號：G010M，性狀：無色透明液體。細菌內毒素檢查用水（以下簡稱BET水），湛江安度斯生物有限公司，批號：1806130，規格：50ml/瓶。鎂離子緩沖液，湛江安度斯生物有限公司，批號：2005210，規格：4ml/支。鱟試劑，湛江安度斯生物有限公司，批號：2004280，靈敏度：0.005EU/ml，標示檢測限50-0.005EU/ml。細菌內毒素工作標準品，中國食品藥品檢驗研究院，批號：150800-201987，規格：80EU/支；批號：150800-202088，規格：60EU/支。

1.2 儀器 EasyBET細菌內毒素測定系統，型號：BET-48G，生產單位：湛江安度斯生物有限公司，工作狀態正常。

2 方法與結果

苯磺順阿曲庫銨注射液內毒素限值為：3.0EU/mg，按其規格：5ml:10mg計算，其濃度為2mg/ml，折合內毒素限值為6.0EU/ml。

2.1 采用滅菌注射用水稀釋步驟與測定方法

2.1.1 內毒素標準品的配制 取1支內毒素標準品（60EU/支）+BET水1.0ml→60EU/m l；取0.5 m l（6 0 E U/m l）+B E T 水2.5ml→10EU/ml；取2ml（10EU/ml）+BET水2ml→5EU/ml；取1ml（5EU/ml）+BET水4ml→1EU/ml；取2ml（10EU/ml）+BET水2ml→0.5EU/ml；取1ml（0.5EU/ml）+BET水4ml→0.1EU/ml；取2ml（0.1EU/ml）+BET水2ml→0.05EU/ml；取1ml（0.05EU/ml）+BET水4ml→0.01EU/m l；取2 m l（0.0 1 E U/m l）+B E T 水2ml→0.005EU/ml。

2.1.2 供試品溶液的制備 M V D=L/λ=6.0EU/ml÷0.005EU/ml=1200倍。取0.2ml樣品溶液+BET水1.8ml→10倍稀釋液；取0.2ml（10倍稀釋液）+BET水1.8ml→100倍稀釋液；取0.5ml（100倍稀釋液）+BET水2.5ml→600倍稀釋液；取1ml（600倍稀釋液）+BET水1ml→1200倍稀釋液。

2.1.3 供試品陽性溶液的制備 取0.5ml（600倍稀釋液）+0.5ml內毒素標準品溶液（0.16EU/ml）→1200倍稀釋陽性溶液（0.08EU/ml）。

2.1.4 測定方法 將溶解的鱟試劑分裝到無熱原的儀器專用檢測管內，每只檢測管內加0.1ml，然后按順序分別加入0.1ml的內毒素標準品溶液或稀釋好的供試品溶液、供試品陽性溶液，陰性孔加入內毒素檢查用水，陽性孔加入0.5EU/ml的內毒素標準品溶液，輕輕混勻后放入細菌內毒素測定儀設定位置，儀器自動開始檢測。按照中國藥典2020年版四部通則1143中光度測定法進行數據統計與結果計算。

2.1.5 采用細菌內毒素檢查用水作為稀釋劑的測定結果 從實驗結果看，樣品回收率為28%，小于50%，說明其方法學驗證不通過，見表1。

表1 細菌內毒素檢查用水為稀釋劑的測定結果

2.2 采用鎂離子緩沖液稀釋步驟與測定方法[1]

2.2.1 鎂離子緩沖液（陰性對照）的稀釋取10ml鎂離子緩沖液+BET水50mlBET水→60ml（6倍鎂離子稀釋液）；取20ml（6倍鎂離子稀釋液）+BET水20ml→40ml（12倍鎂離子稀釋液）。

實驗前，采用凝膠法測定鎂離子緩沖液的內毒素含量，檢查結果顯示，鎂離子緩沖液的內毒素小于0.015EU/ml，與細菌內毒素檢查用水的內毒素要求限值一致。

2.2.2 內毒素標準品稀釋 取1支內毒素標準品（60EU/支）+BET水1.0ml→60EU/ml；取0.5ml（60EU/ml）+BET水2.5ml→10EU/ml；取2ml（10EU/ml）+6倍鎂離子稀釋液2ml→5EU/ml；取1ml（5EU/ml）+12倍鎂離子稀釋液4ml→1EU/ml；取2ml（10EU/ml）+12倍鎂離子稀釋液2ml→0.5EU/ml；取1ml（0.5EU/ml）+12倍鎂離子稀釋液4ml→0.1EU/ml；取2ml（0.1EU/ml）+12倍鎂離子稀釋液2ml→0.05EU/ml；取1ml（0.05EU/ml）+12倍鎂離子稀釋液4ml→0.01EU/ml；取2ml（0.01EU/ml）+12倍鎂離子稀釋液2ml→0.005EU/ml。

2.2.3 供試品溶液的制備 MVD=L/λ=6.0EU/ml÷0.005EU/ml=1200倍。取0.5ml樣品+BET水4.5ml→10倍稀釋液；取0.5ml（10倍稀釋液）+BET水4.5ml→100倍稀釋液；取1ml（100倍稀釋液）+BET水2ml→300倍稀釋液；取2ml（300倍稀釋液）+6倍鎂離子稀釋液2ml→600倍稀釋液；取1ml（600倍稀釋液）+12倍鎂離子稀釋液1ml→1200倍稀釋液。

2.2.4 供試品陽性溶液制備 取1ml（600倍樣品稀釋液）+1ml內毒素標準品溶液（1EU/ml）→1200倍稀釋陽性溶液（0.5EU/ml）。

2.2.5 測定方法 將溶解的鱟試劑分裝到無熱原的儀器專用檢測管內，每只檢測管內加0.1ml，然后按順序分別加入0.1ml的內毒素標準品溶液或稀釋好的供試品溶液、供試品陽性溶液，陰性孔加入12倍鎂離子稀釋液，陽性孔加入0.5EU/ml的內毒素標準品溶液，輕輕混勻后放入細菌內毒素測定儀設定位置，儀器自動開始檢測。按照中國藥典2015年版四部通則1143中光度測定法進行數據統計與結果計算。

2.2.6 采用鎂離子緩沖液作為稀釋劑的測定結果 從測定結果看，以鎂離子緩沖液作為稀釋劑，在此對苯磺順阿曲庫銨注射液進行細菌內毒素的測定，其方法學驗證結果符合實驗成立條件，則認為結果準確，見表2。

表2 鎂離子緩沖液為稀釋劑的測定結果

2.3 結果 苯磺順阿曲庫銨注射液使用細菌內毒素檢查用水和鎂離子緩沖液作為稀釋劑進行細菌內毒素檢查結果顯示，兩種稀釋方法的線性回歸方程分別為：LgTg=2.6768-0.2684LgC和LgTg=0.42533-0.03972LgC，相關系數分別為：-0.9961和0.9975；兩種稀釋方法中內毒素標準品和樣品不同稀釋倍數及干擾管的變異系數均小于10%；兩種稀釋方法中內毒素的回收率分別為28%和89%。由此可見，采用細菌內毒素檢查用水作為稀釋劑時，其內毒素回收率低于50%，與《中國藥典》規定的回收率應在50%-200%不相符，實驗不成立。采用鎂離子緩沖液作為稀釋劑對樣品和標準品進行稀釋并測定，其結果回收率為89%，符合實驗成立要求。則苯磺順阿曲庫銨注射液在進行細菌內毒素檢查時應使用鎂離子緩沖液作為稀釋劑，實驗方可成立。

3 討論

苯磺順阿曲庫銨注射液對內毒素有抑制作用，補充適量的二價離子可有效消除苯磺順阿曲庫銨注射液對細菌內毒素檢查的抑制[3]。鎂離子緩沖液是一種輔助劑，用于枸櫞酸鹽類抗凝劑及一些會導致鱟試驗反應溶液中二鉀離子缺失的樣品的細菌內毒素檢查。在使用鎂離子緩沖液對樣品進行稀釋后再根據動態顯色法進行檢查，結果表明方法可行。

目前對于苯磺順阿曲庫銨注射液的內毒素檢測，文獻報道中提及可用凝膠法[4]，但有關其采用動態顯色法對細菌內毒素進行質量控制的措施卻沒有提及。在文獻[3]報道中，為消除苯磺順阿曲庫銨對內毒素的抑制作用，可使用稀釋劑Ⅰ作為溶劑。稀釋劑Ⅰ是一種輔助劑，含有一定濃度的二價離子，可飽和枸櫞酸鹽的螯合反應，維持鱟試劑的正常靈敏度，并有較強的pH緩沖能力，使反應介質保持反應所需的最佳pH。近來湛江安度斯生物有限公司將稀釋劑Ⅰ更名為鎂離子緩沖液。

目前苯磺順阿曲庫銨注射液的質量標準中，越來越多的企業選擇使用與進口品種相同的標準進行內毒素檢查，即使用動態顯色法，而不再使用凝膠法，但所有涉及苯磺順阿曲庫銨注射液品種的質量標準中，僅寫明“采用動態顯色法進行內毒素的測定”，但對其實驗過程中藥品主要成分對內毒素有抑制作用，需采用鎂離子緩沖液對樣品進行稀釋后測定并未寫明。故筆者認為，在后續企業的標準提高和該品種的日常檢驗中，應寫明實驗過程中采用的稀釋劑，以便更好地完善質量標準，對該品種的安全性質量控制有重要的意義和價值[5-22]。