pre-S基因變異與乙型肝炎病毒感染患者肝功能和肝纖維化的相關(guān)性

馬苗苗,劉 媛

陜西省西安市第五醫(yī)院檢驗科,陜西西安 710082

HBV感染可致使機(jī)體肝臟炎癥損傷,不及時治療可導(dǎo)致HBV反復(fù)感染,導(dǎo)致患者的肝功能發(fā)生難以逆轉(zhuǎn)的損傷,增加肝硬化等不良預(yù)后的發(fā)生風(fēng)險[1]。目前HBV感染患者預(yù)后的具體影響機(jī)制尚未清晰,明確其發(fā)生的相關(guān)機(jī)制對于患者病情的早期控制可能具有積極意義。研究發(fā)現(xiàn),HBV由S區(qū)、X區(qū)等4個編碼區(qū)構(gòu)成,其中S區(qū)包括pre-S基因和S基因區(qū),而pre-S基因與HBV復(fù)制、侵襲、機(jī)體免疫等均具有明顯的關(guān)系[2]。有研究發(fā)現(xiàn),機(jī)體中HBV-DNA極易由于宿主免疫、藥物等的影響,在反轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生變異,其中pre-S基因變異發(fā)生率較高[3]。研究認(rèn)為,pre-S基因變異能夠促使HBV免疫逃逸,是導(dǎo)致HBV感染患者病情進(jìn)展的重要因素[4]。但是目前關(guān)于pre-S基因變異與HBV感染患者肝功能和肝臟纖維化指標(biāo)關(guān)系的研究較少。因此,本研究納入HBV感染患者178例,對此進(jìn)行了分析,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年12月至2022年6月本院收治的HBV感染者178例作為研究對象,其中無癥狀HBV攜帶患者65例作為對照組,慢性乙型肝炎(CHB)患者70例作為CHB組,乙型肝炎肝硬化患者43例作為肝硬化組。納入標(biāo)準(zhǔn):各組均根據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南:2019版》[5]進(jìn)行診斷,并符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn);基因型均為HBV C型;HBV-DNA定量檢測均≥104IU/mL;均成功獲取pre-S基因序列。排除標(biāo)準(zhǔn):合并丙型肝炎等其他肝臟疾病;有外科手術(shù)史;存在精神障礙;患惡性腫瘤;患血液系統(tǒng)疾病;有近6個月抗病毒等相關(guān)治療史;患其他感染性疾病;有藥物依賴史;有酗酒史。對照組中男41例、女24例,年齡31～54歲、平均(42.78±5.96)歲。CHB組中男45例、女25例,年齡29～57歲、平均(42.37±5.73)歲。肝硬化組中男27例、女16例,年齡32～56歲、平均(42.49±6.01)歲。3組基礎(chǔ)資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核(LIB-20230533)。所有患者對本研究均知情同意。

1.2方法 采集3組患者清晨空腹靜脈血10 mL,使用美國Beckman AU5821全自動生化分析儀測定肝功能,相關(guān)指標(biāo)包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、清蛋白。使用放射免疫法測定肝臟纖維化指標(biāo),相關(guān)指標(biāo)包括層粘連蛋白、透明質(zhì)酸以及Ⅲ型前膠原肽,試劑盒購自上海透景生命科技股份有限公司,嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

取3組患者血清,使用核酸提取試劑盒(寧波海爾施基因科技有限公司)進(jìn)行HBV-DNA的提取。將待測HBV-DNA作為模板,使用巢式PCR法對HBV pre-S基因進(jìn)行擴(kuò)增。引物設(shè)計為IF:5′-ACCWTATWCYTGGGAACAA-3′;IR:5′-GAGAGAAGTCCACCACGAGT-3′;ⅠaF:5′-ACCWTATWCTGGGAACAA-3′;ⅠaR:5′-TTCCACTGCATGGCCTGAGGATGA-3′;ⅠbF:5′-GACTYGTGGACTTCTC-3′;ⅠbR:5′-GGGGTCCTAGGAATCCTGATG-3′。2輪PCR反應(yīng)體系均為50 μL,其中首輪PCR擴(kuò)增程序:94 ℃3 min預(yù)熱,94 ℃30 s變性,根據(jù)引物序列的不同使用差異化的退火溫度,退火 30 s,延伸72 ℃ 30 s,隨后95 ℃30 s開展30個循環(huán),延伸72 ℃ 10 min。取首輪PCR產(chǎn)物作為第2輪PCR的模板,PCR擴(kuò)增程序同首輪PCR。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,確認(rèn)產(chǎn)物質(zhì)量,隨后使用PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化,并開展pre-S基因序列的測定。使用Lasergene軟件拼接序列,使用GenBank數(shù)據(jù)庫內(nèi)已知基因型HBV毒株的參考序列與檢測序列進(jìn)行核苷酸序列比對,檢測pre-S基因變異情況。其中pre-S基因變異包括缺失變異、T3116m變異、起始密碼子變異、T53m變異等,納入HBV感染患者中頻率超過10%的變異進(jìn)行研究。根據(jù)是否發(fā)生基因缺失變異,將HBV感染患者分為變異組和非變異組。

1.3觀察指標(biāo) 比較對照組、CHB組、肝硬化組患者的pre-S基因變異情況、肝功能和肝纖維化指標(biāo)水平。比較變異組和非變異組的肝功能和肝纖維化指標(biāo)水平。

2 結(jié) 果

2.1對照組、CHB組、肝硬化組患者的pre-S基因變異情況比較 對照組和CHB組pre-S基因缺失變異率明顯低于肝硬化組,CHB組pre-S基因缺失變異率明顯低于肝硬化組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組、CHB組以及肝硬化組T3116m變異率、起始密碼子變異率、T53m變異率以及A3120m變異率比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 對照組、CHB組、肝硬化組患者的pre-S基因變異情況比較[n(%)]

2.2對照組、CHB組、肝硬化組患者的肝功能和肝纖維化指標(biāo)水平比較 對照組和CHB組ALT、AST、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸以及Ⅲ型前膠原肽水平明顯低于肝硬化組,清蛋白水平明顯高于肝硬化組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組ALT、AST、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸以及Ⅲ型前膠原肽水平明顯低于CHB組,清蛋白水平明顯高于CHB組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 對照組、CHB組、肝硬化組患者的肝功能和肝纖維化指標(biāo)水平比較

2.3變異組和非變異組患者的肝功能和肝纖維化指標(biāo)水平比較 將43例基因缺失變異患者納入變異組,135例非基因缺失變異患者納入非變異組。非變異組ALT、AST、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸以及Ⅲ型前膠原肽水平均明顯低于變異組,清蛋白水平明顯高于變異組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 變異組和非變異組患者的肝功能和肝纖維化指標(biāo)水平比較

2.4pre-S基因變異類型與患者肝功能和肝纖維化指標(biāo)的相關(guān)性 pre-S基因缺失變異與ALT、AST、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸、Ⅲ型前膠原肽水平均呈正相關(guān)(P<0.05),與清蛋白水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。T3116m變異、起始密碼子變異、T53m變異、A3120m變異與ALT、AST、清蛋白、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸、Ⅲ型前膠原肽水平均無相關(guān)性(P>0.05)。見表4。

表4 患者肝功能和肝纖維化指標(biāo)與pre-S基因變異類型的相關(guān)性

3 討 論

HBV屬于DNA病毒,其中pre-S基因為HBV基因組中較易發(fā)生變異的區(qū)域,主要包括pre-S1、pre-S2基因,可通過編碼pre-S1、pre-S2等HBV外膜蛋白,參與HBV的復(fù)制、侵襲、機(jī)體免疫反應(yīng)等過程[6-7]。pre-S基因變異主要包括缺失、起始密碼子突變等類型,能夠通過改變病毒復(fù)制、機(jī)體免疫應(yīng)答等機(jī)制促進(jìn)HBV感染疾病的進(jìn)展[8-9]。目前認(rèn)為,不同地區(qū)HBV感染患者的pre-S變異類型具有一定差異,關(guān)于pre-S變異類型與HBV感染患者病情的關(guān)系尚存在爭議[10]。其中pre-S基因缺失變異被認(rèn)為是預(yù)測肝細(xì)胞癌發(fā)生和術(shù)后復(fù)發(fā)的有效生物標(biāo)志物[11]。本研究發(fā)現(xiàn),隨著HBV感染患者病情的進(jìn)展,pre-S基因變異率明顯提高,尤其是pre-S缺失變異率,這可能是由于pre-S基因的缺失變異能夠影響病毒復(fù)制、與宿主的結(jié)合、免疫應(yīng)答等生理過程,并可促使乙型肝炎表面抗原(HBsAg)水平增加以及在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的累積,使HBV顆粒的合成減少,導(dǎo)致毛玻璃樣肝細(xì)胞的發(fā)生,進(jìn)而加重肝臟損傷,促使患者病情進(jìn)展,增加了肝硬化等的發(fā)生風(fēng)險[12]。此外,本研究發(fā)現(xiàn),在HBV感染患者中,除了pre-S基因缺失發(fā)生頻率較高以外,常見的基因變異還包括起始密碼子變異。研究發(fā)現(xiàn),pre-S基因起始密碼子變異能夠?qū)幼踊钚援a(chǎn)生抑制作用,使小S蛋白合成受阻,HBsAg合成異常,進(jìn)而不利于病毒顆粒的裝配與釋放[13]。但是本研究發(fā)現(xiàn),對照組、CHB組、肝硬化組間起始密碼子變異率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。關(guān)于起始密碼子變異與HBV感染患者病情的關(guān)系需納入更多樣本進(jìn)行深入分析。

ALT、AST、清蛋白是衡量機(jī)體肝功能的常用指標(biāo),層粘連蛋白、透明質(zhì)酸以及Ⅲ型前膠原肽是評估機(jī)體肝臟纖維化嚴(yán)重程度的有效指標(biāo),在臨床中均應(yīng)用廣泛。本研究發(fā)現(xiàn),ALT、AST、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸、Ⅲ型前膠原肽水平在對照組、CHB組以及肝硬化組中逐漸增加,清蛋白在對照組、CHB組以及肝硬化組中逐漸降低,提示隨著HBV感染患者病情嚴(yán)重程度的增加,肝功能損傷和肝臟纖維化均逐漸加重。這可能是由于HBV感染對肝臟產(chǎn)生炎癥刺激,促使肝細(xì)胞損傷,進(jìn)而導(dǎo)致肝功能異常;HBV感染能夠增強(qiáng)肝星狀細(xì)胞活性,導(dǎo)致細(xì)胞間基質(zhì)在肝臟累積,進(jìn)而促使肝臟纖維化的進(jìn)展[14]。此外,有研究認(rèn)為,T3116m為HBV感染患者發(fā)生肝硬化的獨(dú)立影響因素[15],但是本研究中并未見此關(guān)聯(lián),可能是樣本差異所致。關(guān)于T3116m與乙型肝炎肝硬化的關(guān)系需深入分析。

本研究發(fā)現(xiàn),變異組ALT、AST、清蛋白、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸、Ⅲ型前膠原肽水平與非變異組比較,均具有明顯差異,且HBV感染患者肝功能、肝硬化指標(biāo)水平與pre-S基因缺失明顯相關(guān),進(jìn)一步提示pre-S基因缺失可能通過改變肝功能、加快肝臟纖維化進(jìn)程,促進(jìn)HBV感染病情的進(jìn)展。這可能是由于pre-S1基因與病毒增殖周期有關(guān),pre-S1基因的缺失可阻礙機(jī)體免疫系統(tǒng)對pre-S1蛋白的識別,抑制相應(yīng)抗體的合成,進(jìn)而不利于機(jī)體對病毒的清除[16-17]。pre-S2基因可通過pre-S2蛋白的表達(dá),減少HBV所致炎癥損傷,pre-S2基因表達(dá)的缺失可抑制機(jī)體免疫反應(yīng),加重HBV感染;可阻礙HBV小蛋白等的分泌,促使大球形HBV顆粒表達(dá)增加[18-19]。也有研究發(fā)現(xiàn),肝硬化失代償期患者pre-S基因缺失率明顯高于代償期[20]。關(guān)于pre-S基因缺失情況與肝硬化患者病情嚴(yán)重程度的關(guān)系仍需進(jìn)一步分析。

綜上所述,pre-S基因缺失變異與HBV感染患者肝功能和肝纖維化指標(biāo)明顯相關(guān)。臨床中對于pre-S基因缺失的HBV感染患者,應(yīng)密切關(guān)注其肝功能和肝纖維化指標(biāo)水平的變化,并及時進(jìn)行對癥治療,以延緩病情進(jìn)展,改善患者預(yù)后。