不同中藥制劑對熱應激母豬血清抗氧化能力和抗炎作用的影響

相亦飛,韋玉衡,王熾康,莫奕豪,吳莉芩,易丹丹,覃蘭遷,劉 霞,黃 玲,張志賓,何家康

(1.廣西大學動物科學技術學院,廣西 南寧 530005 ; 2.保定冀中藥業有限公司,河北 保定 071599)

熱應激是指動物機體對極端高溫高濕的外界環境所做的非特異性反應[1,2]。中獸醫辨證中,熱應激是由于暑、濕二邪侵入機體所引起的外感熱病[3],大量文獻表明,動物處于熱應激狀態時,機體會伴隨氧化應激損傷和炎癥反應[4-9]。高溫高濕是廣西地區在養殖生產過程中的重大挑戰,炎熱的外界環境極易造成動物熱應激反應,豬對其尤為敏感。研究表明,僅熱應激就可導致美國的生豬產業損失達數億美元[10],我國生豬養殖規模巨大,熱應激所帶來的危害更加嚴重,尤其在南方地區更加顯著[11]。

中藥制劑替代抗生素緩解家畜熱應激是近些年來業內研究的熱點。本試驗于2021年6月18～7月8日在廣西某養殖場進行,符合熱應激條件。選用市售玉屏風顆粒和麻杏石甘顆粒作為試驗藥物,在相同養殖環境下拌料給藥,用于考察其緩解母豬熱應激的效果。對母豬熱應激環境病例進行分組給藥,每天記錄棟舍的溫濕度,計算每日平均溫濕度和溫濕指數(Temperature and humidity index,THI),分別于給藥前、后測定母豬的血清抗氧化能力和炎性因子水平,旨在評價不同中藥制劑對母豬熱應激的緩解作用,為該藥用于緩解母豬熱應激提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥物 玉屏風顆粒(獸藥字030065327,批號:202105016)和麻杏石甘顆粒(獸藥字030066161,批號:202105044),均由保定冀中藥業有限公司提供,并經廣西壯族自治區獸藥監察所檢驗合格。

1.1.2 主要試劑 丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)試劑盒,均購自上海碧云天生物技術有限公司;總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)、還原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和一氧化氮(Nitric oxide,NO)試劑盒,均購自南京建成生物工程研究所;白細胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)ELISA試劑盒,均購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 Multimode Plate Reader型多功能酶標儀,瑞士TECAN公司產品;TGL20MC型臺式高速冷凍離心機,西安禾普生物科技有限公司產品;SIM-F140AY65制冰機,日本SANYO公司產品;C150型二氧化碳培養箱,德國BINDER公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組與給藥方案 試驗在廣西壯族自治區貴港市某集約化養豬場進行,在相同的飼養環境下,選擇妊娠日齡在107 d左右的二元母豬(長白×大白)75頭,隨機分為A、B、C三個組,每組25頭,進行拌料給藥。給藥方案為:A(玉屏風顆粒)組:4.0 g/(頭·d),連續給藥21 d;B(麻杏石甘顆粒)組:3.0 g/(頭·d),連續給藥21 d;C(熱應激模型)組:不給藥。試驗期間記錄豬群采食、飲水、精神狀態和臨床表現。

1.2.2 溫濕度記錄和THI計算 將溫濕度計掛于離地1.5 m處,試驗期間(每天8:00、14:00和22:00)記錄棟舍溫度(Temperature,T)和濕度(Relative humidity,RH),根據公式(1)計算THI[12]。

THI=(1.8×T+32)-[(0.55-0.005 5×RH)×(1.8×T-26)]

(1)

1.2.3 樣品處理 給藥前(0 d)和給藥后第7、21天,早上飼喂前于母豬前腔靜脈采血10 mL,采血時減少大幅度晃動以避免溶血,4 ℃靜置2 h,3 000 r/min離心10 min,取上層血清備用[13]。

1.2.4 血清抗氧化能力和炎性因子水平測定 根據試劑盒說明書操作,測定母豬血清中抗氧化能力指標MDA、SOD、T-AOC、GSH和NO水平;使用ELISA試劑盒測定炎性因子IL-1β和IL-6水平。

1.2.5 統計分析 用Excel統計并計算各項指標,利用GraphPad Prism 9進行單因素方差分析,比較各組母豬抗氧化能力和炎性因子水平,試驗結果以“平均值±標準差”表示。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 溫濕度記錄和THI計算 如圖1所示,試驗21 d期間,有20 d棟舍日平均溫度均高于高溫臨界值27 ℃,21 d THI值均高于72,THI<72為正常,THI≥72為熱應激。結果表明,選取的規模化豬場符合試驗要求,試驗母豬群一直處于熱應激狀態,符合廣西地區夏季高溫高濕的養殖特點。

圖1 棟舍溫濕度和溫濕指數(THI)Fig.1 Temperature, humidity and temperature-humidity index (THI) in barns

2.2 母豬臨床表現 連續給藥21 d后發現,相比不給藥母豬群,給藥母豬群的采食量增加0.1～0.2 kg/頭,食欲和飲欲較好;母豬表現為飲水量增加、反應靈敏、乳房飽滿,使得仔豬可以獲得充足的乳汁來提高自身免疫力;仔豬表現為體態勻稱、皮毛光亮、反應靈敏、聲音清脆洪亮、糞尿正常,無扎堆現象。結果表明,飼喂玉屏風顆粒和麻杏石甘顆粒均對母豬的臨床表現有一定改善。

2.3 不同中藥制劑對血清抗氧化能力的影響 如表1所示,在高溫高濕的外界環境下,母豬血清MDA和T-AOC水平偏高,SOD、GSH和NO水平偏低,處于異常生理狀態[1,11,14,15]。連續給藥7 d時,與熱應激模型組相比,玉屏風顆粒組母豬血清SOD和NO水平顯著升高(P<0.05),MDA、T-AOC和GSH水平無明顯差異(P>0.05);麻杏石甘顆粒組與熱應激模型組各血清抗氧化物水平均無明顯差異(P>0.05)。連續給藥21 d時,與熱應激模型組相比,玉屏風顆粒組血清SOD和NO水平極顯著升高(P<0.01),MDA水平顯著降低(P<0.05),T-AOC和GSH水平顯著升高(P<0.05);麻杏石甘顆粒組血清MDA水平極顯著降低(P<0.01),SOD、T-AOC和GSH水平均顯著升高(P<0.05),NO水平有所升高但差異不顯著(P>0.05)。結果表明,給予玉屏風顆粒可改善母豬血清MDA、SOD、T-AOC、GSH和NO水平;給予麻杏石甘顆粒可改善母豬血清MDA、SOD、T-AOC和GSH水平。在給藥療程方面,連續給藥21 d相較于給藥7 d,各項指標改善更為明顯。

2.4 不同中藥制劑對血清炎性因子水平的影響 熱應激極易影響機體正常的新陳代謝,加快水分蒸發,使動物快速脫水,導致酸堿平衡和電解質紊亂。如表2所示,試驗母豬血清炎性因子IL-1β和IL-6水平均處于異常狀態。連續給藥7 d時,與熱應激模型組相比,玉屏風顆粒組母豬血清IL-1β和IL-6水平顯著降低(P<0.05),麻杏石甘顆粒組改善不明顯(P>0.05)。連續給藥21 d時,與熱應激模型組相比,玉屏風顆粒組血清IL-1β和IL-6水平極顯著降低(P<0.01),麻杏石甘顆粒組差異不顯著(P>0.05)。結果表明,給予玉屏風顆粒7 d即可改善母豬血清炎性因子水平,給予麻杏石甘顆粒對母豬血清炎性因子水平改善不顯著;在給藥療程方面,連續給藥21 d對血清炎性因子的改善作用顯著優于連續給藥7 d。

3 討論

在我國南方地區,高溫高濕的養殖環境極易誘發妊娠母豬的熱應激狀態,該病理狀態嚴重影響母豬正常的生產性能和經濟價值。溫濕度是生豬養殖過程中非常重要的外界環境因素,據文獻報道,妊娠母豬適宜的環境溫度為13～20 ℃,母豬妊娠前期適宜溫度為13～19 ℃,妊娠后期適宜溫度為16～20 ℃,高溫臨界值為27 ℃[1,11,16,17]。本試驗母豬群一直處于輕度或中度熱應激狀態。

多種細胞因子的轉運都需要以血液為載體,故分離血清檢測機體抗氧化能力和炎性因子水平可以直觀反應機體生理機能狀態的改變[11]。研究表明,氧化與抗氧化在機體內常處于動態平衡狀態,高溫高濕是導致熱應激的重要外界刺激源,可以引起動物機體的抗氧化能力減弱,在使機體代謝增強的同時產生過多的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),使得機體氧化與抗氧化失去平衡,造成機體嚴重的氧化損傷[18-20]。文獻表明,MDA、SOD、T-AOC、GSH和NO均是動物機體酶促系統中重要的抗氧化酶[21]。紀敏[22]研究證明,中藥成分迷迭香酸可以有效逆轉化療藥物導致的小鼠肝腎氧化應激損傷和炎癥反應。張露蓉等[23]研究表明,玉屏風散對化療藥物引起的小鼠肝臟、腎臟和肺臟的氧化損傷有明顯的改善作用。張瓊等[24]研究表明,玉屏風顆粒對大鼠鼻炎具有一定的治療作用,可降低血清中白細胞介素4(Interleukin-4,IL-4)和IL-6水平。沈學懷等[15]研究表明,給予母豬復方中藥發酵飼料,可顯著改善其抗氧化水平,降低機體氧化應激損傷。上述研究表明,中藥成分可有效逆轉畜禽的氧化損傷,提高機體的抗氧化能力。炎性細胞因子趨于正常范圍是維持機體正常生理狀態的必要條件,炎癥反應和機體的抗氧化能力聯系緊密,一般機體內的炎性細胞因子分為抗炎和促炎兩類,IL-1β和IL-6是促炎因子的指征性指標,可加速炎癥反應的發生。文獻表明,正常生理狀態下炎性因子對機體有一定的保護能力,炎性因子過度表達會誘發機體的炎性細胞反應紊亂[9,25,26],引起機體臟器損傷,導致機體免疫力下降[9,26-28]。

廣西地區高溫高濕的外界環境常會引起動物機體代謝增強,誘發機體產生氧化應激損傷和炎癥反應。抗生素的大量使用會造成畜禽體內的獸藥殘留,危害人類生命健康和環境衛生安全,國家限抗令的頒布加快了獸醫臨床尋找抗生素替代藥物的進程。中藥制劑或中藥單體成分有明顯的抗氧化和抗炎活性,通過清除機體所產生的過多的ROS,使動物機體抗氧化能力處于動態平衡狀態,同時使炎性因子恢復到正常范圍,對于緩解或預防畜禽熱應激有著很好的臨床療效。麻杏石甘顆粒是《傷寒論》中的經典名方,主要由麻黃、苦杏仁、石膏和甘草等中藥組成,有散熱、解毒、止咳、化痰和平喘的功效。楊毅等[29]研究表明,麻杏石甘湯可下調腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-6、白細胞介素8(Interleukin-8,IL-8)等炎性因子水平,同時具有明顯的抗病毒作用。狄雯雯等[30]研究表明,麻杏石甘制劑可明顯緩解患兒血清的氧化應激狀態、減輕炎癥反應、提高其免疫機能。玉屏風顆粒出自南宋名醫張松所的著作《究原方》,主要由黃芪、白術(炒)和防風等中藥組成,有益氣固表和提高機體免疫力的功效。有研究表明,黃芪通過增強機體免疫力,可顯著改善仔豬的消化和吸收功能、改善腸道內環境,加快仔豬的生長速度、大幅提升日增重、降低料肉比,提高機體抗應激能力和抗病力以及提高仔豬的成活率[31];白術對腫瘤具有很好的抑制作用,可調節機體免疫功能[32],還可有效緩解小鼠的急性肝損傷,有效調節胃腸運動,并且有很好的抗炎活性[33];防風具有明顯的抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤和增強免疫系統的功能[34]。本試驗母豬長時間處于熱應激狀態,其生產性能以及氧化應激和炎癥水平都處于異常狀態。通過本試驗發現,玉屏風顆粒有較好的抗氧化應激和抗炎作用,麻杏石甘顆粒有較好的抗氧化應激作用,與文獻報道基本一致,飼喂玉屏風顆粒可以更好地提高母豬的抗氧化能力,降低機體應激損傷水平,改善母豬血清炎性因子水平,使母豬炎性細胞因子恢復到正常的穩定狀態,減少炎癥反應的發生。