致雛鵝痛風新型鵝星狀病毒的分離鑒定和致病性試驗

張 紅,田秋豐,王志強,黃宇翔,鄒 躍,呂明哲,楊昊天,馬志剛,霍明東,董佳強,楊 坤,魏念冬,苗 艷,鐘 鵬,陳志峰

(黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院,黑龍江 齊齊哈爾 161005)

星狀病毒(Astrovirus,AstV)為單股正鏈無囊膜結構的RNA病毒。目前,星狀病毒科(Astroviridae)可分為2個屬,即哺乳動物星狀病毒屬和禽星狀病毒屬。哺乳動物星狀病毒屬感染的宿主包括人類和一些哺乳動物,禽星狀病毒屬感染的宿主包括雞、火雞、鴨、鵝和其他鳥類[1]。AstV具有高度的遺傳多樣性和基因重組潛力,因此存在跨物種傳播的可能性[2,3]。鵝感染星狀病毒后主要引起雛鵝心臟、肝臟和腎臟尿酸鹽沉積,導致痛風、跛行、生產性能下降甚至死亡[4,5]。該病的發病地域非常廣泛,給養鵝業造成巨大的經濟損失[6,7]。本試驗以黑龍江省齊齊哈爾市某鵝場內發生雛鵝痛風的病死雛鵝為研究對象,進行病原分離、病毒株傳代培養、PCR擴增、基因序列分析和動物回歸試驗,試驗結果可為鵝星狀病毒(Goose astrovirus,GoAstV)的進一步深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2019年5月,黑龍江省齊齊哈爾市某鵝場養殖10 000只雛鵝,于5日齡開始發病,13日齡死亡雛鵝數量達到2 000只,低溫送檢10只具有痛風癥狀的病死雛鵝,無菌采集病死雛鵝的脾臟、肝臟和腎臟,放入-80 ℃保存備用。

1.1.2 試驗動物 12胚齡健康鵝胚和1日齡健康雛鵝,均購自齊齊哈爾山海養殖專業合作社,經檢測,GoAstV、小鵝瘟病毒(Goose parvovirus,GPV)、鵝副黏病毒(Goose paramyxoviru,GPMV)、禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)和坦布蘇病毒(Tembusu virus,TMUV)抗原均為陰性。

1.1.3 主要試劑 病毒DNA/RNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒,均購自天根生化科技(北京)有限公司;反轉錄試劑盒、Premix PrimeSTAR HS、pMDTM19-T載體、PCR產物快速連接試劑盒和DNA Marker(DL2 000),均購自寶生物工程(大連)有限公司;DH5α感受態細胞,購自上海唯地生物技術有限公司。

1.1.4 主要儀器 基因擴增儀(T30,杭州朗基科學儀器有限公司);微型高速離心機(MiniSpan Plus,杭州奧盛儀器有限公司);干式恒溫器(MK-20,杭州奧盛儀器有限公司);恒溫水槽(DK-8D,上海一恒科學儀器有限公司);全自動多功能孵化機(D247,德州富民孵化設備研制中心);電熱恒溫培養箱(DH-4000Ⅱ型,天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 將采集的肝臟、脾臟和腎臟組織病料放入研缽中,按組織重量與生理鹽水1∶5加入0.9%生理鹽水,一邊加入生理鹽水一邊充分研磨,制備懸液,反復凍融3次,8 000 r/min離心10 min,取上清于干凈的EP管中。用0.22 μm濾器對上清液進行過濾除菌,并經尿囊膜接種于12日齡鵝胚,接種劑量為0.3 mL/枚,共接種6枚。置38 ℃孵育,每日觀察鵝胚死亡情況,棄去24 h內死亡鵝胚,收集168 h內死亡鵝胚的尿囊液和胚體。

1.2.2 引物設計 根據GenBank中已發表GoAstV毒株HLJ01全基因序列(登錄號為MN175321),使用Oligo7.0和Primer Premier 5.0軟件設計3對引物,引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表1。

表1 PCR引物信息Table 1 PCR primer details

1.2.3 PCR擴增 將收集到的死亡鵝胚尿囊液,按照病毒DNA/RNA抽提試劑盒說明書操作,抽提尿囊液的總DNA/RNA,按照反轉錄試劑盒說明書操作將RNA反轉錄為cDNA。用抽提的DNA或反轉錄的cDNA為模板,分別進行GoAstV、GPV、GPMV、TMUV和FAdV的PCR檢測。GoAstV反應體系(50 μL):2×Master Mix 25 μL,上、下游引物各1 μL,模板2 μL,超純水補足至50 μL。反應程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,53 ℃(GoAstVORF2-1)、55 ℃(GoAstVORF2-2)和57 ℃(GoAstVORF2-3)退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環;最后72 ℃延伸5 min。GPV、GPMV、TMUV和FADV的PCR檢測方法參照參考文獻[8-10],PCR擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.4 PCR產物序列測定和分析 PCR產物膠回收后連接pMD19TM-T載體,送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序所得結果拼接,將所得序列在NCBI網站上進行Blast同源性比對,與GenBank已發布的其他不同種屬星狀病毒進行同源性分析,運用MEGA 7.0軟件和鄰接法(Neighbor-joining,NJ)構建系統發育進化樹。

1.2.5 動物回歸試驗 將30只1日齡健康雛鵝隨機分成2個組,試驗組20只,對照組10只,隔離飼養。試驗組皮下接種純化后毒株的F3代尿囊液,1.0 mL/只,對照組接種相同劑量的無菌生理鹽水。每日觀察并記錄2個組雛鵝的發病和死亡情況。對接種后發病死亡的雛鵝進行及時剖檢,觀察各組織臟器和關節等處的病理變化。

2 結果

2.1 病毒分離 將疑似感染GoAstV病鵝的組織研磨濾液接種鵝胚,其在鵝胚上可以穩定傳代,連傳3代,鵝胚集中在72～168 h死亡,死亡率約達90%,死亡鵝胚尿囊膜增厚并有尿酸鹽沉積,胚體嚴重充血、水腫、呈潮紅色(圖1)。

圖1 死亡鵝胚的胚體變化Fig.1 Embryo body changes in dead goose embryosA:胚體充血、水腫、呈潮紅色; B:尿囊膜增厚A:Embryonic congestion, edema and appearing bright-red; B:Thickening of the allantoic membrane

2.2 PCR擴增 結果顯示,僅GoAstV為陽性,GPV、GPMV、TMUV和FAdV均為陰性。分離毒株在約600、700和800 bp處出現與預期大小一致的目的條帶(圖2),表明分離病毒為GoAstV,命名為Goose Astrovirus/Heilongjiang/QS1/2022株(簡稱QS1株)。

圖2 分離毒株的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of the isolated strainsM:DL-2 000 DNA 相對分子質量標準; 1～3:鵝星狀病毒; 4:小鵝瘟病毒; 5:鵝副黏病毒; 6:坦布蘇病毒;7:禽腺病毒; 8:陰性對照M:DL-2 000 DNA Marker; 1-3:GoAstV; 4:GPV; 5:GPMV;6:TMUV; 7:FAdV; 8:Negative control

2.3 PCR產物序列測定和分析 將分離毒株QS1的基因序列測序結果與GenBank上已發表的其他星狀病毒的核苷酸序列進行同源性比較,結果顯示,分離毒株QS1與近年來報道引起痛風的新型GoAstV毒株HNSQ-6、HNKF-1、HNNY0620和XT1的核苷酸同源性較高,達99.58%～99.72%。系統進化樹如圖3所示,分離毒株QS1與同源性較高的GoAstV毒株HNSQ-6、HNKF-1、HNNY0620和XT1在同一分支上;與其他GoAstV毒株FLX、AHDY和SCCD處于同一進化分支中不同的進化亞分支;與鴨源星狀病毒遺傳距離較遠。由此可見,導致該鵝場出現鵝痛風的星狀病毒為GoAstV 2型。

圖3 分離毒株QS1與其他星狀病毒的系統發育進化樹Fig.3 Phylogenetic evolutionary tree of isolated QS1 strain and other AstV strains▲:本試驗分離毒株QS1▲:QS1 strain isolated in this study

2.4 動物回歸試驗 試驗組雛鵝接種分離毒株F3代尿囊液48 h后出現臨床癥狀,表現為精神沉郁,食欲不振,呆立;72 h后開始出現死亡,死亡率為70%,發病率為100%。病死雛鵝及時剖檢可見心臟、肝臟表面有大量尿酸鹽沉積;腎臟明顯腫大,表面偶有尿酸鹽沉積,輸尿管變粗,內有大量白色石灰樣沉淀物;膽囊腫大,顏色變淺,內有白色石灰樣結晶顆粒;剖開腕關節可見白色石灰樣沉積物(圖4)。試驗組未死亡雛鵝比對照組雛鵝明顯消瘦。對照組雛鵝未見明顯臨床癥狀,無死亡。

圖4 病死雛鵝剖檢觀察Fig.4 Autopsy observation of dead goslingsA:腕關節處有石灰樣尿酸鹽沉積; B:整個心臟、部分肝臟表面有石灰樣尿酸鹽沉積; C:腎臟腫脹,輸尿管變粗,內有大量石灰樣尿酸鹽沉積; D:膽囊腫大,內有石灰樣結晶顆粒A: Lime-like urate deposits at the wrist joint; B: Lime-like urate deposits on the entire surface of the heart and part of the liver; C: Swollen kidneys, dilated ureters with abundant lime-like urate deposits; D: Enlarged gallbladder with lime-like crystalline particles inside

3 討論

禽星狀病毒已被證明在家禽中與腹瀉、生長抑制、腎炎和腸炎有關[11]。自2016年以來,我國各地均有報道以雛鵝發生痛風為特征的病例[12,13],鵝感染AstV后主要引起雛鵝心臟、肝臟和腎臟尿酸鹽沉積,導致痛風、跛行、生產性能下降,給養鵝業造成巨大的經濟損失。

本試驗分離鑒定的QS1株經系統發育進化樹分析結果顯示,分離毒株QS1屬于禽星狀病毒的1個新毒株,與近年來報道引起痛風的新型GoAstV的核苷酸同源性最高。致病性試驗結果顯示,QS1感染雛鵝后發病率為100%,死亡率為70%,屬于強毒株。而Zhang等[14]從具有痛風癥狀的雛鵝中分離鑒定出1種新型GoAstV,致病性試驗表明,所有感染的雛鵝在感染后2周內均存活。這與本致病性試驗結果截然不同,可能與感染途徑、劑量和年齡存在差異有關。

有報道顯示,感染GoAstV死亡雛鵝的腎小管內存在蛋白物質,表明GoAstV可以導致腎組織上皮細胞通透性增強,腎小管上皮細胞發生變性、壞死,導致雛鵝腎臟功能損傷[15-17]。本試驗剖檢試驗組雛鵝時,可見輸尿管內有大量的尿酸鹽沉積。嚴重的尿酸沉積可能會阻塞腎小管,造成腎組織損傷,從而減少尿酸排泄,使血液中尿酸含量增加[18,19]。尿酸通過血液循環轉移至身體的各個器官,因此,心臟、肝臟和腎臟等血液灌注量大的器官,痛風病變更為明顯。本試驗結果與Zhang等[20]和Yin等[21]報道的結果基本一致,由此可見,GoAstV感染引起的雛鵝腎臟損傷可能是導致雛鵝痛風的主要原因。

AstV全基因組均包含3個開放閱讀框(Open reading frame,ORF),分別為ORF1a、ORF1b和ORF2。ORF1a和ORF1b基因編碼非結構蛋白;ORF2基因編碼衣殼蛋白的前體結構蛋白,在蛋白水解成熟、病毒傳染性、病毒與宿主抗體和補體相互作用及病毒入侵宿主細胞中發揮重要作用[22,23]。本試驗為將ORF2基因成功擴增,根據基因序列共設計3對引物,通過PCR擴增獲得了分離毒株QS1的3段ORF2基因序列,為下一步表達相關蛋白和后續試驗提供參考。

經GoAstV感染的雛鵝除痛風表現外,還會出現食欲不振或廢絕,從而嚴重抑制生長[24,25],即使發病后未死亡雛鵝,其飼料轉化率也會嚴重下降,造成生長緩慢,給鵝產業造成巨大的經濟損失[26]。本試驗發現,低溫、高濕、通風條件差和飼養管理不到位是導致雛鵝發病率和死亡率高的主要原因,此外,飼料中的高蛋白水平是否會促進痛風的發生還需要進一步研究。目前,針對新型GoAstV引起的雛鵝痛風尚無有效的治療措施,預防GoAstV也無商品化疫苗,因此預防GoAstV感染,應規范飼養管理、減少鵝應激和加強對鵝舍的消毒。對于發病的場區要嚴格消毒、嚴格隔離和嚴禁帶毒鵝的流通擴散。加快滅活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗的研制,通過對鵝群免疫接種,獲得免疫力和保護力是預防本病的有效手段。

本試驗從黑龍江省齊齊哈爾市某鵝場采集具有痛風癥狀雛鵝的病變組織,通過鵝胚分離、PCR擴增、基因序列分析和動物回歸試驗證實鵝痛風病的致病原為GoAstV,命名為QS1株。遺傳進化分析表明,該病毒分離株與近年來新型GoAstV分離株同源性較高,可引起雛鵝死亡,死亡率可達70%。本試驗結果為后續GoAstV疫苗和診斷試劑的研制提供了原材料。