質譜技術用于細菌耐藥性檢測的研究進展

段 鍛,江海洋,吳聰明

(中國農業大學動物醫學院,北京 海淀 100193)

近年來,全球細菌耐藥性快速發展,妨礙抗菌藥物療效,增加細菌感染的治療失敗風險,嚴重威脅動物和人類健康[1]。細菌耐藥表型的快速檢測可以指導人醫和獸醫臨床用藥,是對抗耐藥細菌感染的有效手段。目前,基于微生物培養的傳統藥敏試驗是細菌耐藥性檢測的主要手段,包括微量肉湯稀釋法、紙片擴散法和抗生素濃度梯度法等[2]。雖然傳統藥敏試驗準確度較高,但檢測周期長(通常為24 h),不能夠滿足臨床用藥的時效需求,特別是對于菌血癥等重癥感染病例的治療[3]。隨著測序技術的發展,測定細菌耐藥基因型的方法在一定程度上可以指導臨床用藥,但細菌耐藥機制復雜,存在耐藥基因型與表型不一致的現象,因此耐藥基因型對臨床用藥的指導意義有限[4]。

質譜儀是用來進行質量分析的儀器,具有靈敏度高、分析速度快、測量范圍廣和色譜聯用等特點。早期,質譜技術主要用于化合物結構鑒定[5];近年來,質譜技術開始應用于蛋白質、肽、寡核苷酸、脂類和多糖等生物大分子的分析[6]。常用于細菌耐藥性檢測的質譜儀有基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)、液相色譜-串聯質譜(Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)和軌道阱組合質譜。目前,主要通過檢測細菌蛋白質的指紋圖譜分析其耐藥性,MALDI-TOF MS在人醫臨床中廣泛應用于細菌屬種鑒定和重要細菌耐藥特征鑒定,但在獸醫臨床中應用較少;LC-MS/MS通常用來檢測小分子的耐藥生物標志物并且可以對其進行定量,適用于部分耐藥機制清楚的細菌;軌道阱組合質譜因其高分辨率常用來識別耐藥細菌的特征肽段。結合機器學習,應用質譜技術已實現細菌耐藥特征的快速預測,但受限于儀器性能、耐藥機制和數據分析方法等因素,該技術仍處于探索發展階段。本文介紹了當前將質譜技術應用于細菌耐藥性檢測的兩類技術原理和相關方法,簡述了其在人醫和獸醫臨床的應用情況、發展方向和前景展望。

1 質譜技術檢測細菌耐藥性的原理和應用情況

1.1 基于細菌與抗生素孵育的檢測

1.1.1 檢測抗生素的質量變化 細菌表達耐藥酶作用于抗生素使其結構和分子量發生變化,質譜技術可通過檢測抗生素代謝產物來判定細菌耐藥性的存在[7]。Serafim等[8]用LC-MS/MS技術檢測肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、斯氏普羅威登斯菌和鮑曼不動桿菌共4種革蘭陰性菌對氨芐西林、美羅培南、亞胺培南、頭孢他啶、頭孢曲松和頭孢吡肟共6種抗生素的耐藥性,將每種細菌分別與6種抗生素的混合物一起孵育,使用LC-MS/MS檢測抗生素的代謝產物,結果顯示,LC-MS/MS和商業化藥敏平臺的檢測結果具有一致性,且LC-MS/MS檢測所需時間為3～5 h,小于商業化藥敏平臺檢測所需時間(8 h)。

由于采用質譜檢測耐藥細菌中抗生素的代謝產物不需要過長時間的增菌,利用該原理開發的方法檢測時間短,還可進一步結合微流控或微膠囊等技術縮短檢測時間。Zhang等[9]開發了一種質譜結合微流控芯片的系統,成功區分了2株產超廣譜β-內酰胺酶的大腸桿菌和2株不產超廣譜β-內酰胺酶的大腸桿菌,該系統原理為注射的β-內酰胺類抗生素通過芯片時,抗生素被芯片上固定的細菌代謝通過對抗生素的代謝產物進行在線電噴霧質譜分析,可以在30 min內評估細菌耐藥性。這種方法當前主要用于產β-內酰胺酶類耐藥細菌的檢測,并且通過抗生素代謝產物的定量實現對細菌耐藥程度的劃分,有希望與傳統藥敏試驗的判讀結果實現轉換。盡管存在以上優點,該方法仍僅適用于產生破壞抗生素結構酶的耐藥細菌的檢測,不適用存在外排泵作用增強或作用靶點改變等機制的耐藥細菌的檢測。

1.1.2 檢測細菌同位素標記蛋白 細菌在同位素標記培養基中生長時,細菌蛋白被同位素標記,在質譜檢測時相對正常細菌存在蛋白峰移現象。因此,向同位素標記培養基中加入抗生素,耐藥細菌可以生長合成同位素標記蛋白;而敏感細菌生長緩慢或不生長,較少或無法合成同位素標記蛋白;根據細菌在同位素標記培養基中生長的特征峰總強度與正常培養基中生長的特征峰總強度的比值設置合理的閾值,可以區分耐藥細菌和敏感細菌,實現耐藥性的半定量檢測[10]。

2013年,Sparbier等[10]用4株甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌和4株甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌作為建立檢測方法的菌株,每株菌株分別在正常培養基、加同位素標記培養基以及加60 mg/L苯唑西林和同位素標記培養基于37 ℃培養3 h,然后進行MALDI-TOF MS檢測,通過軟件選取細菌在正常培養基和加同位素標記培養基中生長的特征峰,進一步通過軟件計算后設置閾值為0.5,小于0.5判定為耐藥細菌;隨后用該新建立的方法分析28株金黃色葡萄球菌對苯唑西林的耐藥性,結果顯示,與傳統藥敏試驗相比,僅有1株細菌分類錯誤。2016年,Sparbier等[11]應用上述建立的方法檢測了多種細菌對不同抗生素的耐藥性,包括頭孢喹肟-大腸桿菌、美羅培南-肺炎克雷伯菌、美羅培南-銅綠假單胞菌、妥布霉素-肺炎克雷伯菌、妥布霉素-銅綠假單胞菌和妥布霉素-鮑曼不動桿菌,結果顯示,上述組合培養和檢測所需的時間介于3～9 h,即可在短時間內實現不同菌種對不同抗生素耐藥性的半定量檢測。該方法利用質譜間接檢測了細菌的生長情況,理論上不受耐藥機制的限制,并且與檢測細菌生長情況的傳統藥敏試驗相比,時間能縮短到幾個小時,且能較好地區分耐藥細菌和敏感細菌;但該方法需要使用特殊的培養基和有代表性的譜圖,操作繁瑣,檢測成本高,因此應用較少。

1.2 基于耐藥細菌生物標志物的檢測

1.2.1 檢測耐藥性相關標志物 細菌耐藥表型由耐藥基因型決定,根據已知耐藥基因所表達的耐藥蛋白或其他耐藥生物標志物的分子量,可通過質譜檢測耐藥蛋白或耐藥生物標志物以判斷細菌耐藥性[12]。Camara等[13]通過MALDI-TOF MS成功檢測到質荷比(m/z)=29 000處的峰,經過聚丙烯酰胺凝膠電泳和LC-MS/MS試驗證實m/z=29 000處的蛋白為氨芐青霉素抗性基因表達的β-內酰胺酶。該方法不僅可以鑒定細菌屬種,而且可以檢測基于β-內酰胺酶的抗生素耐藥性,細菌不需要在選擇性培養基中生長,可縮短檢測時間,從而使醫生能夠及時做出適當的治療決定。

Dortet等[14]開發了一種基于MALDI-TOF MS檢測細菌多黏菌素耐藥性的方法,可在15 min內檢測到細菌上與多黏菌素耐藥相關的脂質A修飾,鑒定出多黏菌素耐藥分離株,同時區分染色體編碼的耐藥和質粒編碼的耐藥。該方法具有準確、快速和成本低的優勢,促進了多黏菌素的耐藥性診斷。

在已知生物標志物m/z的基礎上再利用MALDI-TOF MS,使得樣品的前處理過程變得簡單,縮短了檢測時間;缺點為即使已知某些生物標志物,但其在質譜中的響應值很低,無法達到檢測的標準,或者基質效應明顯,這時可以嘗試更復雜的前處理技術或者進行色譜分離后再進行質譜檢測。

1.2.2 檢測耐藥細菌特征肽段 質譜不僅可以直接檢測耐藥蛋白,還可以檢測耐藥蛋白水解后的特異性多肽片段[15]。細菌蛋白質樣品經胰蛋白酶消化,經色譜分離和高分辨質譜識別肽段后采用低分辨質譜進行肽段定量。在此過程中,高效的蛋白質消化對于分析過程至關重要。這種方法也得益于軌道阱組合質譜的發展,該質譜能夠準確識別蛋白水解后的各種肽段。

Wang等[16]利用蛋白質組學結合軟件預測的方法,從可轉移黏菌素耐藥(Mobile colistin resistance,MCR)蛋白家族中的12種蛋白中初步篩選出MCR-1蛋白特有的胰蛋白酶酶切后的肽段,然后通過LC-MS/MS鑒定了3個MCR-1蛋白的特異性肽段,隨后用臨床分離的9株攜帶MCR-1蛋白的陽性菌和90株陰性質控菌對該方法進行驗證,結果顯示其敏感性和特異性均達100%。Wang等[17]還采用類似的方法篩選出3個肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiellapneumoniaecarbapenemase,KPC)的特異性肽段,KPC經胰蛋白酶快速消化后得到的特異性肽段可通過LC-MS/MS檢測,蛋白印跡分析證實所選擇的特異性肽段為KPC所特有,隨后用20份KPC陽性和80份KPC陰性臨床分離株進行驗證試驗,結果顯示,最可靠的胰蛋白酶標記物是LTLGSALAAPQR,具有100%的敏感性和100%的特異性。這種方法的缺點是在消化過程中僅使用胰蛋白酶[18],對蛋白質組信息的挖掘不完整,且需要較復雜的前處理。有研究提出使用多種蛋白酶進行蛋白質消化以提高蛋白質序列的覆蓋率[19,20],克服質譜對于蛋白質質量檢測范圍的限制,即只需知道對應的特征蛋白就可以設計相應的檢測肽,因此適用范圍很廣。

1.2.3 檢測細菌指紋圖譜 MALDI-TOF MS已經廣泛應用于臨床細菌屬種的快速鑒定[21,22]。與細菌屬種鑒定的原理類似,通過MALDI-TOF MS采集已知敏感細菌和耐藥細菌的譜圖,進行譜圖分析,尋找耐藥細菌的一系列特征峰。隨著計算機科學的發展,目前可利用算法軟件輔助尋找最合適的預測模型,使得挑選特征峰變得更加快速和準確。Giordano等[23]從比薩大學醫院2015—2017年的住院患者中采集139株肺炎克雷伯菌,對疑似多黏菌素耐藥菌株進行全基因組測序后,再通過蛋白提取上機進行MALDI-TOF MS鑒定,創建特定的數據庫并形成算法分類模型,共收集了1 112個質譜圖,根據質量信號和強度創建了二維峰值分布,基于2種手動選擇質譜峰值建立的算法識別能力為91.8%,交叉驗證能力為87.6%,該方法可正確分辨出91%的多黏菌素耐藥菌株和73%的多黏菌素敏感菌株。

此外,Weis等[24]在2016—2018年間收集了臨床分離菌株的303 195份MALDI-TOF MS數據和相應的768 300個耐藥表型信息,這是目前將質譜數據與細菌耐藥性信息相結合的最大的數據集;然后使用2種機器學習方法對數據集進行分類,預測細菌對不同抗生素的耐藥性,并對金黃色葡萄球菌、大腸肝菌和肺炎克雷伯菌三類臨床上重要的病原菌進行驗證,結果顯示,接收者操作特征曲線下的面積分別為0.80、0.74和0.74,對63名患者臨床病例的回顧性研究發現,實施這種預測方法改變了9名患者的臨床治療方案,其中有利于8名患者的治療。以上結果表明,基于MALDI-TOF MS的機器學習可以預測臨床中的抗生素耐藥性,并幫助醫生更快地為患者制定合適的抗生素療法。但是,這種方法前期需要得到大量具有代表性的菌株圖譜,并且選擇合適的預測模型也至關重要。目前所建立的方法仍需要更多的菌株進行分析和驗證,以提高方法的準確性和特異性。但與檢測生物標志物或細菌生長狀態的方法相比,該方法用機器學習的方式獲得耐藥細菌的特征并進行耐藥性預測,不受抗生素種類和耐藥機制的限制,且菌株僅需進行基本的上機前處理,具有非常大的臨床應用潛力。

2 質譜技術檢測細菌耐藥性在獸醫領域的應用

目前,質譜技術檢測動物源細菌耐藥性主要是以機器學習預測耐藥性為主。雖然應用質譜進行細菌耐藥性的研究主要集中于人源細菌,但研究發現,食品零售店的肉類中的耐藥細菌可以傳播給人類[25],人源性耐藥細菌與動物源耐藥細菌關系密切。另外已有應用質譜檢測動物源耐藥細菌的報道,細菌種類包括腸球菌、大腸桿菌和空腸彎曲桿菌等[26],但未見有沙門菌等重要食源性致病菌的相關研究。

Feucherolles等[27]收集了來自人、地表水、浣熊、野鳥、牛、豬和家禽的224株空腸彎曲桿菌和116株大腸桿菌,通過MALDI-TOF MS獲得譜圖信息后使用機器學習建立模型,對環丙沙星、紅霉素、四環素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素和氨芐西林共7種抗生素進行耐藥性預測,結果顯示,使用隨機森林模型對環丙沙星耐藥菌株和四環素耐藥菌株的分類效果最好,靈敏度和精確度分別為92.3%和81.2%。利用機器學習分析質譜數據來預測細菌耐藥性具有非常大的潛力,有望成為監測動物源細菌耐藥性的新技術。

3 質譜技術的發展方向和前景展望

傳統藥敏試驗結果可以被劃分為耐藥、中介和敏感,但利用質譜技術檢測細菌的生長情況目前仍然可能將具有中等耐藥的菌株錯誤分類。未來仍然需要將細菌的培養條件和檢測條件進一步優化,以及通過更多樣本的數據分析來實現與傳統藥敏試驗結果的轉換,這對臨床應用具有重要意義。由于質譜檢測蛋白質、多肽和脂類等細菌耐藥的生物標志物不能直接提供細菌對藥物敏感程度的相關信息,只能通過間接檢測生物標志物來判斷該菌株是否為耐藥細菌,所以更適合用于提供有關耐藥機制的信息以輔助精準治療,也可以用于耐藥機制的研究,如尋找新的耐藥靶標。目前,研究人員也在嘗試將質量分析器串聯或者液相系統與質譜聯用,如液相系統與MALDI-TOF MS 結合使用以擴大可檢測蛋白質的數量,進一步提高高分辨質譜發現生物標志物的能力[28]。盡管利用機器學習分析質譜數據進行耐藥性預測仍存在一些問題,但該方法具有應用于臨床檢測耐藥細菌的巨大潛力,需要優化預測模型并對多種耐藥細菌進一步研究。

另外,MALDI-TOF MS直接進行基因檢測已有一些應用,其主要用來檢測單核苷酸多態性、基因突變和DNA甲基化[29]。有研究成功利用MALDI-TOF MS檢測到ORF1ab基因和N基因,并將其作為新型冠狀病毒的檢測靶標[30]。也有研究建立核酸飛行質譜方法檢測結核耐藥基因突變體系[31]。雖然該方法目前仍需要PCR技術輔助,但也可作為對微生物間接測序的一種手段,質譜核酸測序仍有很大的發展空間,未來可能通過質譜對耐藥細菌進行基因測序來鑒定耐藥基因。