車前草多糖對高脂日糧飼喂小鼠脂代謝和氧化應激的影響

張力凡,朱俊義

(通化師范學院生命科學學院 吉林省長白山生物種質資源評價及應用重點實驗室,吉林 通化 134002)

在動物生產中,日糧能量過剩會造成動物體內脂肪沉積,導致肥胖以及相關疾病的發生,進而降低動物的生產性能。先前的研究已經表明,日糧脂肪攝入是機體脂肪沉積的重要因素,而動物日常飲食中高脂肪日糧攝入增加會導致機體的氧化應激反應[1]。氧化應激會導致疾病的出現,從而對動物的生產性能產生負面作用。近年來,中草藥中所含的豐富的多糖、多酚和黃酮等生物活性物質受到越來越多的關注[2]。車前草具有清肝明目、清熱解毒和抗菌抗炎等功效。此外,車前草還具有免疫調節和抗氧化作用,其發揮作用的主要成分是多糖、黃酮、萜類和皂苷等活性成分[3]。研究表明,車前草多糖(Plantain polysaccharide,PLP)能夠清除體內自由基,降低氧化應激反應,同時能夠通過調節Toll樣受體通路,提高機體免疫能力[4,5]。關于PLP是否可改善高脂日糧飼喂導致的機體脂代謝異常和氧化應激的研究較少。因此,本試驗通過在高脂日糧中添加不同劑量PLP,探究PLP對高脂誘導小鼠的脂代謝和氧化應激的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物制備 車前草,購自吉林大藥房;PLP,由吉林醫藥學院公共衛生學院動物生理教研室使用水提醇沉法提取、分離制備得到,提取步驟參照李官浩等[6]方法進行,得率1.63%,純度>97%。

1.2 主要試劑 天冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate aminotransferase,AST)檢測試劑盒、丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase,ALT)檢測試劑盒、過氧化氫酶(Catalase,CAT)檢測試劑盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)檢測試劑盒、甘油三酯(Triglycerides,TG)檢測試劑盒、總膽固醇(Total cholesterol,TC)檢測試劑盒和葡萄糖(Glucose,GLU)檢測試劑盒,均購自南京建成生物工程有限公司。

1.3 試驗設計與飼養管理 試驗所需的150只SPF級雄性健康昆明小鼠由吉林省實驗動物中心提供[生產許可證號:SCXK(吉)2021—0001],初始體重為(21.36±1.08) g。試驗小鼠在(23±3) ℃,光照黑暗時間為12 h/12 h的環境中適應性飼養1周。將小鼠隨機分成5個組,分別為對照(Control,CK)組、高脂日糧(High fat,HF)組、HF+100 mg/(kg·bw)PLP組、HF+200 mg/(kg·bw)PLP組和HF+400 mg/(kg·bw)PLP組,每組30只。CK組小鼠自由采食基礎日糧,每天灌胃0.5 mL純凈水;HF組小鼠自由采食高脂日糧,每天灌胃0.5 mL純凈水;HF+PLP組小鼠自由采食高脂日糧,每天灌胃0.5 mL PLP,每2天對各組小鼠進行1次稱重,根據小鼠的平均體重配置PLP溶液,連續灌胃4周。每天記錄小鼠的采食量和飲水量。試驗期間日糧配方設計方案見表1。

表1 日糧配方設計方案Table 1 Diet formula design plan

1.4 樣品采集 試驗結束前1天,對小鼠進行禁食不禁水12 h,使用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,每組分別選取6只小鼠進行采血,將血液樣本于4 ℃、3 000 r/min離心10 min,分離血清,置于4 ℃保存備用。無菌采集小鼠肝臟,置于液氮中迅速冷凍,然后置于-80 ℃保存,用于后續相關指標的測定。

1.5 指標的測定

1.5.1 小鼠血液生化指標的測定 使用檢測試劑盒對小鼠血清中ALT和AST活性以及TG、TC、HDL-C和LDL-C含量進行測定,具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。GLU采用己糖激酶法進行測定,操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.5.2 小鼠肝臟中TC和TG含量的測定 將小鼠肝臟組織勻漿,4 ℃、3 500 r/min離心15 min,取上清液,按照試劑盒說明書進行操作測定小鼠肝臟中TC和TG含量。

1.5.3 小鼠肝臟抗氧化能力的測定 取小鼠肝臟組織勻漿離心獲得的上清液,按照試劑盒說明書操作測定小鼠肝臟中SOD、GSH-Px和CAT活性以及MDA含量,肝臟中活性氧自由基(Reactive oxygen free species,ROS)含量使用熒光染料2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯并參考Kumar等[7]方法進行測定,以相對熒光強度反映ROS含量。

1.5.4 小鼠肝臟中抗氧化和脂代謝相關基因表達的檢測 將小鼠肝臟在液氮中進行研磨,隨后按照試劑盒說明書操作提取小鼠肝臟中總RNA并進行反轉錄,獲得cDNA樣品。運用 Primer Premier 5.0軟件設計用于實時熒光定量PCR檢測的引物,引物序列見表2,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,目標基因 mRNA 的相對表達水平使用2-ΔΔCt方法計算并以β-actin為內參基因進行校正。

表2 引物信息Table 2 Primer information

1.6 數據分析 使用SPSS 21.0軟件對數據進行單因素方差分析,數值表示為“平均值±標準偏差”,P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 PLP對小鼠體重和血液生化指標的影響 由表3可知,與CK組相比,HF組和HF+PLP組小鼠末體重均顯著升高(P<0.05),血清中TC、TG、LDL-C 和GLU含量以及ALT和AST活性均顯著升高(P<0.05)。與HF組相比,HF+200 mg/(kg·bw)PLP組和HF+400 mg/(kg·bw)PLP組小鼠末體重顯著降低(P<0.05),血清中TC、TG、LDL-C和GLU含量以及AST和ALT活性均顯著降低(P<0.05),HDL-C含量顯著升高(P<0.05);而HF+100 mg/(kg·bw)PLP組小鼠末體重、HDL-C和TG含量以及ALT活性差異不顯著(P>0.05)。

表3 車前草多糖對小鼠體重和血液生化指標的影響Table 3 Effects of plantain polysaccharides on body weight and blood biochemical indexes in mice

2.2 PLP對小鼠肝臟中TC和TG含量的影響 由圖1可知,與CK組相比,HF組小鼠肝臟中TC和TG含量均顯著升高(P<0.05)。與HF組相比,添加不同濃度PLP均可降低小鼠肝臟中TC和TG含量,且該作用呈劑量依賴性,HF+200 mg/(kg·bw)PLP組和HF+400 mg/(kg·bw)PLP組均差異顯著(P<0.05)。

圖1 車前草多糖對小鼠肝臟中TC(A)和TG(B)含量的影響Fig.1 Effects of plantain polysaccharides on TC (A) and TG (B) contents in mouse liver不同小寫字母表示組間差異顯著,P<0.05Different lowercase letters mean significant difference among groups,P<0.05

2.3 PLP對小鼠肝臟氧化應激的影響 由表4可知,與CK組相比,HF組小鼠肝臟中SOD、CAT和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05),而ROS和MDA含量顯著升高(P<0.05)。與HF組相比,添加200 mg/(kg·bw)和400 mg/(kg·bw)PLP顯著提高了高脂飲食小鼠肝臟中SOD、CAT和GSH-Px活性(P<0.05),而顯著降低了ROS和MDA含量(P<0.05);HF+100 mg/(kg·bw)PLP組小鼠肝臟中ROS含量顯著降低(P<0.05),SOD活性顯著升高(P<0.05),而CAT和GSH-Px活性以及MDA含量差異不顯著(P>0.05)。

表4 車前草多糖對小鼠肝臟氧化應激的影響Table 4 Effects of plantain polysaccharides on oxidative stress in mouse liver

2.4 PLP對小鼠肝臟中抗氧化和脂代謝相關基因表達的影響 如圖2所示,與CK組相比,HF組小鼠肝臟中抗氧化相關基因Nrf2和HO-1 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05);日糧中添加PLP則顯著提高了Nrf2和HO-1 mRNA的相對表達量(P<0.05)。與CK組相比,HF組小鼠肝臟中脂代謝相關基因Lpl和Scd1 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05),而Cyp7αl mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。與HF組相比,日糧中添加PLP則顯著提高了CyP7αl mRNA相對表達量(P<0.05),顯著降低了Lpl和Scd1 mRNA相對表達量(P<0.05)。

圖2 車前草多糖對小鼠肝臟中抗氧化和脂代謝相關基因表達的影響Fig.2 Effects of plantain polysaccharides on expressions of antioxidant and lipid metabolism related genes in mouse liverA:Nrf2; B:HO-1; C:Lpl; D:Cyp7αl; E:Scd1

3 討論

肥胖癥被認為是一個重要的健康問題,主要是因為它與危及生命的慢性疾病密切相關[8]。本試驗結果顯示,HF飲食飼喂的小鼠出現了血糖異常、高脂血癥和脂肪肝,這些是代謝綜合征的主要參數。而這些由HF飲食引起的小鼠異常病理生理狀況通過在日糧中補充PLP得到改善。

臨床中常用TC、TG、LDL-C和HDL-C指標來診斷高脂血癥,本試驗結果表明,HF日糧可引起小鼠高脂血癥的發生,這與其他研究的結果一致[9,10];給小鼠飼喂HF飲食可導致小鼠血清中TC、TG和LDL-C含量升高,在小鼠日糧中添加PLP后,小鼠血清中TC、TG和LDL-C含量顯著降低,HDL-C含量顯著升高,小鼠脂代謝異常得到改善。有研究表明,肥胖引起的小鼠脂代謝異常往往伴隨著機體糖代謝異常[11]。Miah等[12]研究表明,HF飲食喂養的大鼠出現了葡萄糖耐受不良。張利娜等[13]研究也指出,給小鼠飼喂高脂飲食后,小鼠GLU顯著升高,與本試驗結果一致;而日糧中添加PLP降低了HF日糧引起的小鼠GLU升高。研究表明,多糖可通過改善機體胰島素敏感性、調節糖代謝過程中關鍵酶α-葡萄糖苷酶的活性和改變腸道菌群等方式改善肥胖引起的機體糖代謝異常[14]。血清中ALT和AST活性增高提示肝臟中線粒體被破壞,細胞膜通透性增加,機體出現肝損傷[15]。本試驗結果顯示,飼喂小鼠HF日糧會引起小鼠血清中ALT和AST活性以顯著升高,而日糧中添加PLP降低了小鼠血清中ALT和AST活性,表明PLP改善了小鼠高脂飲食引起的肝損傷。

肥胖與日糧中脂肪的攝入密切相關,且高脂日糧會增加哺乳動物的氧化應激反應。氧化應激反應增加可導致體內ROS增加,而ROS增多可引起抗氧化酶活性的變化[16]。研究表明,高脂日糧攝入會導致腎臟中的ROS含量和肝臟中的MDA含量顯著升高,腎臟中SOD和CAT活性顯著降低[17]。陳麗梅等[18]研究發現,高脂飼喂小鼠能夠顯著提高肝臟中ALT和AST活性,對肝臟功能有一定損傷,此外,該研究還發現,小鼠肝臟中MDA含量顯著升高,SOD活性和總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)顯著降低,這些結果與本試驗結果一致,HF飲食顯著降低肝臟中SOD、CAT和GSH-Px活性,而顯著提高ROS和MDA含量。研究表明,在HF飲食中添加植物多糖能夠提高動物體內抗氧化酶(如SOD和CAT等)活性[19,20]。本試驗結果也顯示,日糧中添加PLP提高了HF飲食導致的小鼠肝臟中SOD、CAT和GSH-Px活性的降低,并降低了ROS和MDA含量。在本試驗中,日糧中添加PLP顯著上調了HF飲食小鼠肝臟中Nrf2和HO-1的表達,表明PLP可能通過激活Nrf2-HO-1通路和提高抗氧化酶活性來緩解HF飲食導致的氧化應激。

此外,本試驗還測定了脂代謝相關基因Lpl、Cyp7αl和Scd1的表達。Cyp7αl是膽汁酸合成經典途徑的限速酶,催化膽固醇在肝臟分解為膽汁酸;Scd1是催化肝細胞中飽和脂肪酸轉化為單不飽和脂肪酸的限速酶;Lpl是影響乳糜微粒(Chylomicron,CM)和極低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein,V-LDL)等脂蛋白代謝的關鍵因子,Lpl基因表達異常可造成嚴重的以甘油三酯水平升高為主要特征的高乳糜微粒血癥,并出現一系列臨床癥狀[21,22]。研究表明,HF飲食導致小鼠肝臟中Cyp7αl mRNA的表達下調,Lpl和Scd1 mRNA的表達顯著上調;而類蟲草多糖巨寡糖的添加顯著上調HF飲食小鼠肝臟中Cyp7αl mRNA的表達,顯著下調了Lpl和Scd1 mRNA的表達[22]。本試驗結果與此一致,日糧中添加PLP顯著上調HF飲食小鼠肝臟中Cyp7αl基因的表達,顯著下調Lpl和Scd1基因的表達,表明PLP可通過調節小鼠肝臟中脂代謝相關基因的表達而改善HF飲食導致的小鼠肝臟脂代謝異常。

綜上所述,本試驗結果表明,飼喂小鼠HF飲食會引起其脂代謝異常和氧化應激,并導致小鼠高脂血癥。而PLP能夠改善HF飲食小鼠脂代謝相關指標,提高肝臟中抗氧化酶的活性,并改善HF飲食引起的小鼠氧化應激。