貓血漿對稱性二甲基精氨酸參考范圍的建立及其影響因素

林璐琪,陳絲雨,林嘉寶,夏兆飛

(1.中國農業大學動物醫學院,北京 海淀 100193 ; 2.中國農業大學教學動物醫院,北京 海淀 100193)

慢性腎病(Chronic kidney disease,CKD)是貓最常見的疾病之一,在10歲及以上的老年貓中CKD發病率為30%～60%[1,2]。血清肌酐(Creatine,CREA)常用于CKD的診斷,但其水平受肌肉量顯著影響且不能有效診斷早期CKD,因此,尋找可靠的生物標記物對CKD早期診斷尤為重要。對稱性二甲基精氨酸(Symmetric dimethylarginine,SDMA)是在蛋白質降解過程中,由精氨酸甲基化形成的分子[3]。研究表明,血清SDMA水平與動物的腎小球濾過率(Glomerular filtration rate,GFR)相關性良好[4],且不易受到動物體況和營養狀況的干擾[5,6]。

近年來,國外對貓SDMA的研究逐漸增多,而國內少見健康貓和CKD 患貓體內 SDMA水平變化的相關報道。本試驗旨在分析:(1)建立國內健康貓血漿SDMA的參考范圍,探究不同品種、性別、年齡和絕育狀態對SDMA水平的影響;(2)分析不同疾病[CKD、心臟病(Heart disease,HD)、糖尿病(Diabetes mellitus,DM)、腫瘤、貓脂肪肝(Feline hepatic lipidosis,FHL)和貓傳染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis,FIP)]對貓 SDMA水平的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和分組 于2018年6月—2019年1月收集中國農業大學教學動物醫院收診的287例貓病例,分為健康成年對照組(n=100)、慢性腎病組(n=140)、非慢性腎病組(n=47)(無氮質血癥),其中非慢性腎病組分為HD組(n=8)、腫瘤組(n=15)、DM組(n=4)、FHL組(n=10)和FIP組(n=10)。健康成年對照組貓的納入標準:(1)大于1歲;(2)無既往病史,體格檢查正常;(3)血常規、生化、尿液和超聲檢查結果均正常。慢性腎病組患貓納入標準:(1)存在氮質血癥;(2)超聲檢查發現腎臟存在慢性損傷征象;(3)無其他并存疾病。非慢性腎病組患貓納入標準:(1)無氮質血癥;(2)臨床檢查、實驗室檢查和影像學檢查等結果符合HD、腫瘤、DM、FHL和FIP的診斷標準[2]。

1.2 主要試劑 貓對稱性二甲基精氨酸ELISA試劑盒,購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 西門子冰箱,博西華家用電器有限公司產品;全自動生化分析儀,東芝醫療系統(中國)有限公司產品;干燥培養恒溫箱,天津市泰斯特儀器有限公司產品;微型離心機,杭州米歐儀器有限公司產品;多功能酶標儀,賽默飛世爾(上海)儀器有限公司產品。

1.4 貓SDMA參考范圍的建立 取健康成年對照組貓血漿樣本100份,應用貓對稱性二甲基精氨酸ELISA試劑盒檢測SDMA水平,建立 SDMA的參考范圍,范圍以平均數加 1.96 倍標準差表示[95%置信區間(Confidence interval,CI)]。

1.5 年齡、性別、品種對貓血漿SDMA水平的影響 根據收集到的健康成年對照組的病例信息,按照年齡將健康成年對照組貓分為青年組(1～3歲)、中年組(4～10歲)和老年組(≥11歲)3個年齡組;按絕育情況分為雄性組(n=30)、雌性組(n=30)、雄性去勢組(n=26)和雌性絕育組(n=14);按照品種分成家養短毛貓組(Domestic short hair,DSH,n=30)、家養長毛貓組(Domestic long hair,DLH,n=20)、英國短毛貓組(British short hair,BSH,n=15)、美國短毛貓組(American short hair,ASH,n=15)、異國短毛貓組(Exotic short hair,ESH,n=8)、折耳貓組(Scottish Fold,n=4)、暹羅貓組(Siamese,n=3)和其他品種組(Others,n=5)8個品種組;評價不同年齡、性別、品種、絕育/去勢狀態對健康貓血漿SDMA水平的影響。

1.6 疾病因素對貓血漿SDMA水平的影響 根據國際腎病研究學會(International Renal Interest Society,IRIS)的分期指南[7],將CKD組患貓分成CKD-1期組(CREA<140 μmol/L,n=30)、CKD-2期組(CREA介于140～250 μmol/L,n=48)、CKD-3期組(CREA介于251～440 μmol/L,n=31)、CKD-4期組(CREA>440 μmol/L,n=31),檢測以上4個組的血漿 SDMA水平。此外,檢測臨床非氮質血癥的HD組(n=8)、腫瘤組(n=15)、DM組(n=4)、FHL組(n=10)和FIP組(n=10)的血漿 SDMA水平;分析不同疾病對該指標的影響和意義。

1.7 數據處理 使用SPSS 25.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,U.S.A.)和GraphPad Prism 8.0(GraphPad Software Inc.,San Diego,U.S.A.)進行數據分析和圖表制作。對于連續型數據,采用“平均數±標準差”來表示呈正態分布的數據,并采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和 Turkey 事后檢驗來分析不同組之間的差異。而對于不呈正態分布的數據,以“中位數和上下四分位數”表示,并采用非參數檢驗Kruskal-Wallis來比較組間的差異。P>0.05表示差異不顯著,P<0.05表示差異顯著,P<0.01 表示差異極顯著。

2 結果

2.1 健康成年貓SDMA參考范圍 100 份健康成年對照組貓血漿樣本的 SDMA水平呈正態分布(K-S 檢驗,P>0.05,圖1)。經計算,健康成年貓的SDMA參考范圍為0～13.09 μg/dL(CI:95%)。

圖1 健康成年貓SDMA頻數分布Fig.1 Frequency distribution of SDMA in healthy adult cats

2.2 年齡、性別、品種對貓血漿SDMA水平的影響 青年組、中年組和老年組的SDMA水平分別為(6.71±3.42)、(7.53±2.82)和(6.97±2.82) μg/dL,組間無顯著差異(P>0.05)。雄性組、雌性組、雄性去勢組和雌性絕育組的SDMA水平分別為(6.98±3.37)、(7.93±3.15)、(6.38±2.46)和(6.56±3.17) μg/dL,組間無顯著差異(P>0.05)。不同品種分組的SDMA水平無顯著差異(P>0.05,圖2)。

圖2 不同品種健康成年貓SDMA水平Fig.2 SDMA levels in healthy adult cats of different breeds

2.3 疾病因素對貓血漿SDMA水平的影響 對4個分期組CKD患貓進行血漿SDMA水平和CREA水平檢測,結果顯示,與健康成年對照組相比,CKD各分期組SDMA水平均出現極顯著升高(P<0.01)(圖3A),且SDMA水平與CREA水平呈強相關性(r=0.890;P<0.001)(圖3B);血漿CREA水平在4個分期組間差異顯著(P<0.05或P<0.01),但健康成年對照組的血漿CREA水平與CKD-1期組差異不顯著(P>0.05)。

圖3 不同CKD分期患貓SDMA水平(A)以及SDMA水平與CREA水平的相關性(B)Fig.3 SDMA levels in cats with different stages of CKD (A) and the correlation between SDMA levels and CREA levels (B)與前一組對比,*:差異顯著,P<0.05; **:差異極顯著,P<0.01。與健康成年對照組相比,#:差異顯著,P<0.05; ##:差異極顯著,P<0.01Compared with the previous group,*:significant differences,P<0.05; **:extremely significant differences,P<0.01.Compared with the healthy adult control group,#:significant differences,P<0.05; ##:extremely significant differences,P<0.01

對非氮質血癥的HD組、腫瘤組、DM組、FHL組和FIP組病例進行 SDMA檢測,結果顯示,與健康成年對照組相比,FHL組和FIP組血漿SDMA水平均存在極顯著差異(P<0.01),HD組血漿SDMA水平存在顯著差異(P<0.05),腫瘤組和DM組血漿SDMA水平均不存在顯著差異(P>0.05)(圖4)。

圖4 疾病因素對SDMA水平的影響Fig.4 Influence of disease factors on SDMA levels*:組間差異顯著,P<0.05; **:組間差異極顯著,P<0.01*:Significant differences between groups,P<0.05;**:Extremely significant differences between groups,P<0.01

3 討論

本試驗建立了貓血漿SDMA的參考范圍,結果顯示,健康成年貓血漿 SDMA水平不受品種、年齡、性別和絕育/去勢狀態的影響。根據相關指南[8,9]要求,正常參考范圍的建立至少需要120個樣本,但由于試驗周期的局限性,本試驗經過篩選獲得了健康動物樣本100份,結果可能會存在一定的誤差,但整體數據符合正態分布,具有一定的參考意義。本試驗貓血漿SDMA水平所建立的參考范圍(0～13.09 μg/dL)與愛德士參考實驗室(IDEXX Reference Laboratories)的參考范圍(0～14 μg/dL)相似,但參考范圍上限比IDEXX低一些,可能與樣本來源地區、樣本數量和檢測方法差異相關,IDEXX的樣本源于北美洲健康貓,而本試驗的樣本來自中國北京地區,本試驗所用的ELISA試劑盒與IDEXX的高通量免疫測定法存在專利技術的差異,以及潛在的人為操作誤差,均可導致參考范圍的建立出現差別。

本試驗的SDMA水平與CREA水平呈顯著相關性,SDMA的r值(r=0.890;P<0.001)與Jepson等[10]試驗報道的相近(r=0.741;P<0.001),表明SDMA和CREA類似,在指導分期和判斷病情嚴重程度上具備相似的作用。但從文獻中可知,CREA在腎功能平均下降75%時才表現出數值的異常,其敏感性較高而特異性較低;而SDMA在腎功能平均下降40%時就能表現出數值的異常,且比CREA早17個月(時間范圍為1.5～48個月)檢測出CKD[11],因此SDMA在診斷早期CKD上更具有優勢。根據本試驗的結果,SDMA應用于腎病早期診斷的建議是:當血漿SDMA水平大于13.09 μg/dL時,應篩查動物是否存在早期腎病,以提早發現潛在病因。由于國內寵物臨床較難開展GFR檢測,本試驗未對血漿SDMA與GFR相關性展開研究,因此無法計算SDMA的敏感性和特異性。未來的課題需要針對患貓的GFR、尿檢和血壓做進一步關于慢性腎病SDMA水平的研究。此外,若飼主能夠嚴格遵守醫囑,定期帶動物復查,將有助于后期深入研究。

在老年貓中,心臟病和糖尿病是CKD常見的共存病,因此探究這2種疾病是否會影響SDMA水平尤為重要。Langhorn等[12]研究發現,血清SDMA水平在肥厚性心肌病組與健康成年組中無顯著差異,但DM組整體水平低于健康成年組。人醫現已發現,蛋白質精氨酸甲基轉移酶(Protein arginine methyltransferase enzyme,PRMT)Ⅱ型(即PRMT5)與腫瘤有一定的關系,其活性增加會促進SDMA的生成[13],但相關研究還處于探索階段。最近有關于犬貓SDMA水平與各類型腫瘤之間關系的研究結果表明,患有淋巴瘤動物的SDMA水平顯著升高[14]。本試驗結果顯示,健康成年對照組血漿SDMA水平與腫瘤組和DM組差異不顯著,與HD組差異顯著。盡管健康成年對照組的SDMA水平均值與HD組差異顯著,但HD組所有檢測結果均在本試驗所設立的參考范圍內,所以本試驗的結論是心臟病、糖尿病和腫瘤均不會顯著影響血漿SDMA水平。鑒于上述疾病的樣本量較少,若要探究其對SDMA的影響程度,仍需要更深入的研究。

人類醫學研究顯示,體內超過90%的SDMA通過腎臟清除[15],還有一部分通過肝臟清除[16],當肝臟出現功能異常時,可能會引起SDMA水平的升高,脂肪肝、膽管炎、中毒和病毒病都可能會影響肝臟的功能。但也有2篇人醫的報道表明,SDMA水平完全不受肝臟的影響[17,18]。本試驗結果顯示,健康成年對照組血漿SDMA水平與FHL組和FIP組均存在極顯著差異,表明FHL和FIP可能會顯著影響SDMA水平。FIP多發于幼貓,這種疾病的影響是全身性的,所以當SDMA水平在幼年動物體內顯著升高時,除了考慮腎臟的問題,可能還需要注意是否存在代謝性或全身性疾病。但目前獸醫缺乏此類報道,因此需要進一步研究驗證。

綜上所述,血漿SDMA具有診斷貓早期慢性腎病的價值,但不能單獨作為慢性腎病的生物標記物使用,仍需要結合臨床癥狀、臨床病理學檢查和影像學檢查共同評估。