雞蛋中阿莫西林殘留HPLC-DAD檢測方法的建立

肖裕章,姚 靜,孫 毅,畢海林,李 顏,曾孝麗,唐建華,

[1.重慶方通動物藥業有限公司,重慶 榮昌 402460 ; 2.西南大學動物醫學院,重慶 榮昌 402460 ;3. 山東省海陽市綜合行政執法大隊(農業),山東 海陽 265100]

阿莫西林(Amoxicillin,AMO)為半合成的青霉素類藥物,又被稱作羥氨芐青霉素,屬于廣譜β-內酰胺類抗生素,具有抗菌性強、機體吸收快、療效好和價格低等特點,被廣泛應用于臨床各類動物細菌感染性疾病的預防和治療[1-3]。集約化養殖規模的不斷擴大,導致雞的疾病容易集中暴發,尤其是雞的細菌性疾病普遍存在,阿莫西林是抗菌藥中應用最廣泛的一種,對多種導致呼吸道、皮膚軟組織感染的病原微生物十分有效,被普遍應用于敏感菌感染的治療。但由于各類畜禽養殖場的不規范使用,如不遵守休藥期、濫用抗菌藥和超量用藥,導致阿莫西林在動物源性食品(如蛋類、牛奶、肌肉組織和器官等)中存有大量殘留,增加了產生細菌耐藥性的風險。而動物源性食品是人類營養的重要來源之一,人們長期食用有阿莫西林藥物殘留的肉、蛋、奶及其制品,可能會引起人體內多種急慢性中毒、變態反應和消化系統癥狀等不良反應,嚴重影響人類的健康[4]。

我國明確規定產蛋期禁用阿莫西林,農業部在235號公告出具了《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規范[5],其中規定阿莫西林在肉、肝臟等可食用組織中的最大殘留不超過50 μg/kg,牛奶中的最大殘留不超過10 μg/kg,但對于蛋類并未作出明確規定。日本對于蛋類中阿莫西林殘留限量作出明確規定,不得超過10 μg/kg[6]。鑒于此,建立可以準確檢測動物性食品中藥物殘留的方法就具有重要的應用性意義,國內外對動物源性食品中阿莫西林殘留的檢測方法有高效液相色譜法、免疫檢測法、氣相色譜法、微生物法和色譜聯用技術等,但使用高效液相色譜-二級管陣列檢測器(High-performance liquid chromatography-diode array detection,HPLC-DAD)法檢測雞蛋中阿莫西林殘留未見報道,本試驗通過對雞蛋液樣品前處理,結合HPLC-DAD建立了一種安全、操作簡便、可行性高的檢測方法,適用于測定雞蛋中阿莫西林的殘留含量。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑 阿莫西林對照品(批號K0221703,含量為86.6%),購自中國獸醫藥品監察所;甲醇和乙腈(均為色譜級),均購自賽默飛世爾科技有限公司;磷酸、氫氧化鉀、磷酸二氫鉀、二氯甲烷、乙腈和甲醇(均為分析純),均購自重慶川東化工有限公司;屈臣氏蒸餾水,購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司;雞蛋,購自超市。

1.2 主要儀器和設備 安捷倫1260高效液相色譜儀:G7129A VL四元泵、G7115A DAD檢測器、G7111A自動進樣器和LC1260色譜工作站,安捷倫科技(中國)有限公司;TGL-16G臺式離心機,上海菲恰爾分析儀器有限公司;XW-80A漩渦混合器,上海青浦滬儀器廠;80-2臺式低速離心機,上海手術器械廠;移液槍,上海求精生化試劑儀器有限公司;PHS-3C精密pH計,上海精密科學儀器有限公司;BP211D電子天平,賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;HH-S6數顯恒溫水浴鍋,江蘇省金壇市醫療儀器廠;KQ2200B超聲波清洗器,昆山市超聲波儀器廠。

1.3 試劑的配制

1.3.1 0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液 準確稱取KH2PO41.36 g于1 000 mL容量瓶中,加超純水充分溶解并混勻后,定容至刻度線即得(用2 mol/L氫氧化鉀溶液調節pH至5.5)。

1.3.2 阿莫西林標準儲備溶液的制備 精密稱取阿莫西林對照品適量,加流動相溶解,制成濃度為1.0 mg/mL的溶液,并于4 ℃冷藏保存。

1.3.3 阿莫西林對照品溶液的制備 準確移取“1.3.2”中制備的儲備溶液適量,加流動相稀釋,制成濃度為0.05 mg/mL的溶液,備用。

1.3.4 飽和二氯甲烷溶液的制備 向分液漏斗中加入100 mL超純水,再加入二氯甲烷,顛倒混勻后靜置5 min,將下層分離至具塞廣口瓶中備用,即得飽和二氯甲烷溶液。

1.4 色譜條件 色譜柱:采用Welch Uitimate?XB-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm);流動相:0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用2 mol/L氫氧化鉀調節pH至5.5)-乙腈(97.5∶2.5);流速:1.0 mL/min;進樣體積:20 μL;柱溫:30 ℃;檢測波長:230 nm。

1.5 樣品的處理和提取方法 取雞蛋勻漿,精確稱取2.0 g雞蛋勻漿液,置15 mL具塞離心管中,先加入4 mL乙腈溶液進行蛋白沉淀,在渦旋混合器上混合2 min,然后在-18 ℃冰箱中冷凍5 min。以4 000 r/min離心10 min,取上清液,再用上述方法用乙腈再次去除蛋白,結束后將上清液轉移至另一個15 mL離心管中,加入6 mL飽和二氯甲烷溶液,在渦旋混合器上混合2 min,并在-18 ℃冰箱中冷凍5 min,以4 000 r/min離心10 min,取上清水相澄清溶液,過φ0.2 μm微孔濾膜,作為雞蛋供試品,同時制備陰性供試品溶液。

1.6 檢測方法的建立

1.6.1 波長掃描 按照“1.4”所述色譜條件,對阿莫西林對照品溶液進行DAD全波段波長掃描,記錄波譜圖,確定最大吸收波長。

1.6.2 專屬性考察 分別將阿莫西林對照品、雞蛋供試品和陰性供試品溶液進行HPLC測定,記錄并分析色譜圖。

1.6.3 線性關系考察 分別精密移取阿莫西林標準儲備溶液,用流動相進行稀釋、定容并混勻,配制成濃度為100.00、50.00、25.00、10.00、5.00、0.50和0.05 μg/mL的系列工作溶液。經φ0.2 μm微孔濾膜過濾后進樣。以工作溶液實際濃度為橫坐標(X),阿莫西林峰面積響應值為縱坐標(Y),繪制標準曲線,并進行回歸統計。

1.6.4 檢測限和定量限 分別精密移取阿莫西林標準儲備溶液,用流動相進行稀釋、定容并混勻,配制成濃度為25、50、100、200和500 ng/mL的工作溶液樣品,按“1.4”所述色譜條件進行HPLC測定,根據測定所得色譜圖,分析記錄目標峰高與對應的噪聲峰值,計算信噪比(S/N)。當S/N≈3時的濃度即為最低檢測限,當S/N≈10時的濃度即為最低定量限。

1.6.5 精密度考察 取雞蛋供試品溶液,按“1.4”所述色譜條件進行HPLC測定,連續進行6次分析測定,記錄目標峰的峰面積并統計結果。

1.6.6 重復性考察 按照“1.5”所述方法分別制備6份雞蛋供試品溶液,按“1.4”所述色譜條件進行HPLC測定,記錄目標峰的峰面積并統計結果。

1.6.7 供試品穩定性考察 取雞蛋供試品溶液,分別于第0、2、6、8、10、16小時共計6個時間點按“1.4”所述色譜條件進行HPLC測定,記錄目標峰的峰面積并統計結果。

1.6.8 加樣回收率考察 取不含阿莫西林的雞蛋勻漿液,配制成濃度為5.00、25.00和50.00 μg/mL的空白加標樣品。每個濃度分別做3個重復,按照“1.5”所述方法進行樣品處理,按照“1.4”所述色譜條件進行HPLC測定,計算加標試驗回收率。

2 結果

2.1 波長掃描 按照“1.4”所述色譜條件,對阿莫西林對照品溶液進行DAD全波段波長掃描,檢測得到阿莫西林的最大吸收波長在230 nm處(圖1)。

圖1 阿莫西林DAD全波長掃描Fig.1 DAD full-wavelength scan of amoxicillin

2.2 專屬性考察 色譜分析結果顯示,阿莫西林在5.0 min左右出峰,且分離度較好,峰形較佳,同條件下的相同位置的陰性供試品未出現色譜峰,表明陰性供試品中在此保留時間處無干擾峰(圖2)。

圖2 雞蛋中阿莫西林檢測的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of amoxicillin detection in eggsA:陰性供試品溶液; B:阿莫西林對照品溶液; C:雞蛋供試品溶液A:Negative test solution; B:Amoxicillin control solution; C:Egg test solution

2.3 線性關系考察 以阿莫西林峰面積響應值(Y)和阿莫西林工作溶液濃度(X)建立標準曲線(圖3),線性回歸方程為:Y=30.941 69X+14.732 73(R2=0.999 8)。阿莫西林含量在0.05～100.00 μg/mL時,與峰面積具有良好的線性關系。

圖3 阿莫西林溶液標準曲線Fig.3 Standard curve of amoxicillin solution

2.4 檢測限和定量限 結果見表1,本試驗建立方法的檢測限為0.025 μg/mL,定量限為0.050 μg/mL。

表1 雞蛋中阿莫西林檢測限和定量限的信噪比Table 1 Signal-to-noise ratios of limit of detection and limit of quantification for amoxicillin detection in eggs

2.5 精密度考察 結果見表2,連續6次進樣檢測,阿莫西林的峰面積的相對標準偏差為1.00%,符合相關規定要求,說明所用儀器設備的精密度良好。

表2 精密度試驗的測定結果Table 2 Determination results of precision test

2.6 重復性考察 結果見表3,6次重復檢測的峰面積波動不大,相對標準偏差為1.40%,符合方法學考察要求。

表3 重復性試驗的測定結果Table 3 Determination results of repeatability test

2.7 供試品穩定性考察 結果見表4,在第0、2、6、8、10、16小時測定雞蛋供試品溶液均比較穩定,相對標準偏差為1.85%,表明雞蛋供試品溶液穩定性較好,波動不大,符合規定要求。

表4 穩定性試驗的測定結果Table 4 Determination results of stability test

2.8 加樣回收率考察 結果見表5,在本試驗色譜條件和樣品處理方法下,當阿莫西林添加量為5.00～50.00 μg/mL時,樣品平均回收率介于82.89%～89.92%,相對標準偏差介于1.68%～2.71%,均符合相關規范的要求范圍。

表5 回收率的測定結果Table 5 Determination results of recovery rate

3 討論

3.1 檢測方法的選擇分析 目前常用的阿莫西林殘留檢測方法有酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)[7]、液相色譜串聯質譜(Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)[8]、高效液相色譜熒光檢測法[9]、微生物學檢測法[10]、檢測試紙條[11]、種子介導法[12]和高效液相色譜-熒光檢測法[13,14]等。雖然每種方法各有優勢,但也存在很多缺點,快速的檢測方法存在假陽性風險,準確的檢測方法存在操作復雜、耗時長、儀器設備昂貴和試驗要求高等缺陷。目前,普遍以高效液相色譜法[15-18]為基礎來進行殘留檢測,并對色譜條件和樣品處理方法進行優化。本試驗以高效液相色譜法為基礎,選用DAD檢測器進行目標物質全波段掃描,確定阿莫西林最大吸收波長,再根據色譜峰峰型對色譜條件和樣品處理方法進行優化,有效地避免了樣品因蛋白質、降解產物及其他物質對阿莫西林檢測造成的干擾。本試驗結果表明,HPLC-DAD檢測方法具有靈敏性能高、操作過程簡便、所需儀器設備較少和檢測方法可靠等優勢,與苗方等建立的阿莫西林含量HPLC-DAD檢測方法的優勢具有一致性[17]。

3.2 色譜條件的篩選和優化 由于阿莫西林本身極性大,且在紫外末端吸收,一般的檢測方法存在較大的干擾。為了排除干擾,可通過對雞蛋樣品的雙重處理,提高阿莫西林的提取率,本試驗最終選用水飽和的二氯甲烷溶液為樣品前處理的提取溶液,再通過DAD全波段掃描,確定檢測阿莫西林的最大吸收波長為230 nm。通過參考相關文獻,并結合實際試驗,先后比較了磷酸二氫鉀-乙腈[18]、甲醇-水[19]為流動相的檢測結果,發現磷酸二氫鉀-乙腈作為流動相時峰型較好,因此在此基礎上分別對磷酸二氫鉀溶液的濃度和pH進行篩選,比較磷酸二氫鉀溶液濃度為0.01、0.02和0.05 mol/L時的檢測結果,發現其濃度越高柱壓越大,峰型有拖尾現象;比較pH分別為4.5、5.0、5.5和6.0時的檢測結果,最終本試驗確定以0.01 mol/L磷酸二氫鉀-乙腈(97.5∶2.5),pH為5.5作為本試驗流動相,檢測波長為230 nm。

3.3 樣品前處理的優化 由于雞蛋樣品中存在大量的蛋白質,蛋白質對檢測干擾很大,要提取雞蛋中的阿莫西林,關鍵是去除雞蛋樣品中的蛋白質,去除蛋白質的常用溶劑主要有磷酸鹽緩沖液[20]、乙腈[21]和甲醇[22]等,經過試驗對比,乙腈沉淀蛋白質最佳,可使蛋白質呈膠凍硬固狀,便于上清液的吸取,且回收率可達75%以上。其次對雞蛋樣品進一步進行提取和凈化,選用萃取溶劑最為關鍵,有文獻采用二氯甲烷[23]和正己烷[24]作為除蛋白后的進一步提取和凈化的萃取溶劑,經過試驗對比,發現正己烷雖然能夠達到萃取效果,但回收率要低于二氯甲烷,二氯甲烷可將阿莫西林溶于水相的同時,還可溶解沉淀蛋白時殘留的乙腈,進而使阿莫西林的回收率提高至80%以上。因此,本試驗最終確定以乙腈為沉淀蛋白質的溶劑,超純水飽和的二氯甲烷溶液為萃取溶劑,以有效去除蛋白質產生的檢測干擾和提升阿莫西林的回收率。本試驗建立的HPLC-DAD方法操作簡便、耗時較短,可適用于對雞蛋中阿莫西林殘留的準確檢測。