馬屬動物3種寄生線蟲的形態學掃描電鏡觀察

菅 蕊,徐 真,張 晛,韓愛云,呂國平,劇慧棟,5

(1. 承德醫學院基礎醫學院,河北 承德 067000 ; 2. 河北工程大學醫學部,河北 邯鄲 056038 ;3. 石家莊學院化工學院,河北 石家莊 050000 ; 4. 河北中醫藥大學基礎醫學院,河北 石家莊 050000 ;5. 河北省疑難細菌研究重點實驗室,河北 石家莊 050000)

馬屬動物曾在人類發展的歷史中有過重要的貢獻,至今部分馬屬動物仍然被作為人類食物和生物醫學的實驗材料。馬屬動物的寄生線蟲嚴重威脅宿主的生命和健康,是引發各類疾病和死亡的重要因素。不同種類的線蟲對宿主的致病機制各異,因此準確迅速地識別寄生線蟲可以有效降低其對宿主的危害[1,2]。目前,多數馬屬動物寄生線蟲有過光學顯微鏡的觀察和描述,而該類群線蟲在體前端的結構,尤其是頭部乳突、口囊、內葉冠和外葉冠等結構,以及雄蟲尾部的生殖錐的形態,是重要的形態學分類依據,上述結構在光鏡下無法得到滿意的觀察結果,因此,利用掃描電子顯微鏡可以大幅度提高鑒定的準確性,從而對線蟲的種類進行精確鑒定[3-5]。

本試驗首次利用掃描電子顯微鏡技術對采自烏克蘭的馬、斑馬、普氏野馬和驢消化道內杯口屬的不等齒杯口線蟲、拉氏杯口線蟲和副杯口屬的麥氏副杯口線蟲的體表形態進行詳細觀察和描述,為上述3種線蟲的分類鑒定提供更精確的形態學依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 杯口屬的不等齒杯口線蟲、拉氏杯口線蟲和副杯口屬的麥氏副杯口線蟲均采自烏克蘭馬(Equuscaballus)、驢(Equusasinus)、斑馬(Equusburchelli)和普氏野馬(Equusprzewalskii)的腸道內容物,用80 ℃左右的熱水將蟲體燙直,并將線蟲保存于福爾馬林中,記錄宿主的種名、寄生部位、采集時間和地點。

1.2 主要材料 乳酚酸透明液(乳酸∶苯酚∶蒸餾水∶甘油=1∶1∶1∶2),乙醇(50%、70%、80%、90%和100%),0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH=7.2),戊二醛固定液(濃度2.5%),醋酸異戊酯,鋨酸(濃度1%),均由河北師范大學生命科學學院動物系統學與分子進化實驗室配制。

1.3 主要儀器 掃描電子顯微鏡(HITACHI S-4800)。

1.4 線蟲的觀察 將已固定的線蟲標本用80%乙醇或透明液制成臨時裝片,在掃描電子顯微鏡下對線蟲標本的各個部分進行初步的形態觀察,查閱文獻,確定線蟲種類。

取保存于福爾馬林中的線蟲標本,用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗3次,每次15 min;使用戊二醛固定液(濃度2.5%)固定3 h;然后使用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液清洗3次,每次15 min;鋨酸(濃度1%)溶液固定1 min;再用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液清洗3次,每次15 min;再進行脫水,用乙醇作為脫水劑,按照70%、80%、90%和100%的梯度進行2次脫水,每次脫水時間為20 min;將脫水的樣品放入醋酸異戊酯30 min。使用臨界點干燥法進行干燥:(1)樣品室預冷(注入液氮)→(2)樣品放入樣品室→(3)注入液態二氧化碳(樣品室的70%)→(4)用二氧化碳置換樣品中的醋酸異戊酯(溫度調到20 ℃,壓力應達到50～70 kg/cm2,保持20 min)→(5)臨界處理,溫度提高到40 ℃,壓力應達到80～100 kg/cm2,保持5 min→(6)放氣,速度在100～500 mL/min→(7)當壓力低于30 kg/cm2時,切斷加熱器→(8)當壓力為0時,取出樣品,用雙面膠或導電膠將樣品固定在專用的樣品臺上,進行噴金,掃描電子顯微鏡下觀察并拍照[6-8]。

2 結果

2.1 杯口屬Poteriostomum(Quiel,1919)

2.1.1 不等齒杯口線蟲P.imparidentatum(Quiel,1919) 雄蟲、雌蟲各觀察3條,雄蟲和雌蟲在頭端無明顯差異。頸乳突刺狀,長約14 μm(10～17 μm),與排泄孔大致在同一平面(圖1A)。頭徑約205 μm(200～208 μm),口孔直徑約125 μm(121～126 μm),外葉冠82枚,短小,刺狀(圖1B)。口領明顯,在口領頂端的2個正側方各有1個頭感器,2個頭感器之間對稱排列著4個亞中乳突,亞中乳突基部膨大,寬約8 μm(6～11 μm),頂端尖且伸至外葉冠前緣(圖1C)。頭感器較扁平,基部寬約8 μm(5～10 μm)(圖1D)。

圖1 不等齒杯口線蟲的掃描電子顯微鏡觀察Fig.1 Scanning electron microscope observation of P. imparidentatumA:體前端; B:頭部頂面觀,4個近中乳突和2個頭感器; C:近中乳突放大觀; D:頭感器放大觀; E:雄蟲交合傘; F:雄蟲生殖錐放大觀; G:雌蟲尾部; H:雌蟲肛門放大觀A: Anterior end; B: Apical view of the head with four sub-median papillae and two amphids; C: Enlarged view of sub-median papillae; D: Enlarged view of amphids; E: Copulatory bursa of the male; F: Enlarged view of the male genital cone; G: Posterior end of the female; H: Enlarged view of the female anus

雄蟲交合傘短寬,傘緣有鋸齒(圖1 E),生殖錐腹唇錐形,丘狀凸不明顯,背唇附屬物發育不全,皮質領缺乏(圖1 F)。

雌蟲陰門開口橢圓型,寬約48 μm(42～53 μm),距肛門約598 μm(圖1 G),肛門開口弧形,長約220 μm(210～232 μm),尾長約720 μm(700～750 μm)(圖1 H)。

采集地點:烏克蘭

宿主:斑馬(Equusburchelli)、馬(Equuscaballus)

2.1.2 拉氏杯口線蟲P.ratzii(Kotlan,1919) 雄蟲、雌蟲各觀察3條,雄蟲和雌蟲在頭端無明顯差異。頸乳突刺狀,長約25 μm(21～28 μm),與排泄孔大致在同一平面(圖2A～2C)。口領明顯,與體部相接處有環狀突起,頭徑約150 μm(138～163 μm),口孔近圓形,直徑約100 μm(85～108 μm),外葉冠75枚,尖而窄,內葉冠寬度是外葉冠的2倍(圖2D)。亞中乳突細長,圓錐形,基部寬約10 μm(9～11 μm),伸至外葉冠前緣(圖2E)。在口領頂端的2個正側方各有1個頭感器,頭感器寬而鈍圓,頂端有一小孔狀凹陷,基部寬約12 μm(9～14 μm)(圖2F)。

圖2 拉氏杯口線蟲的掃描電子顯微鏡觀察Fig.2 Scanning electron microscope observation of P. ratziiA:體前端; B:排泄孔放大觀; C:頸乳突放大觀; D:頭部頂面觀,4個近中乳突和2個頭感器; E:近中乳突放大觀; F:頭感器放大觀; G:雄蟲交合傘; H:雄蟲生殖錐放大觀; I:雌蟲尾部A: Anterior end; B: Enlarged view of the excretory pore; C: Enlarged view of cervical papilla; D: Apical view of the head with four sub-median papillae and two amphids; E: Enlarged view of sub-median papillae; F: Enlarged view of amphids; G: Copulatory bursa of the male; H: Enlarged view of the male genital cone; I: Posterior end of the female

雄蟲交合傘背葉寬,傘緣鋸齒狀(圖2G),生殖錐皮質領在生殖錐兩側,背唇上的附屬物發育不全(圖2H)。

雌蟲陰門開口近圓形,寬約33 μm(30～36 μm),距肛門約402 μm(390～415 μm),肛門開口半月形,長約245 μm(238～255 μm),尾長約470 μm(455～480 μm)(圖2I)。

采集地點:烏克蘭

宿主:馬(Equuscaballus)

2.2 副杯口屬Parapoteriostomum(Hartwich,1986)

2.2.1 麥氏副杯口線蟲P.mettami(Leiper,1913) 雄蟲、雌蟲各觀察3條,雄蟲和雌蟲在頭端無明顯差異。頸乳突線狀,長約32 μm(28～35 μm),與排泄孔大致在同一平面,排泄孔周圍有一圈皮質凸起,寬約13 μm(10～15 μm)(圖3A～3C)。蟲體中等大小,口領明顯,與體部有明顯環溝隔開,頭部直徑約178 μm(168～185 μm),口孔直徑約52 μm(45～58 μm),外葉冠尖細,75枚(圖3D)。亞中乳突細長,頂端稍微膨大,長約9 μm(7～11 μm)(圖3E)。在口領頂端的2個正側方各有1個頭感器,頭感器裂孔狀,寬約6 μm(5～8 μm)(圖3F)。

圖3 麥氏副杯口線蟲的掃描電子顯微鏡觀察Fig.3 Scanning electron microscope observation of P. mettamiA:體前端; B:排泄孔放大觀; C:頸乳突放大觀; D:頭部頂面觀,4個近中乳突和2個頭感器; E:近中乳突放大觀; F:頭感器放大觀; G:雄蟲交合傘; H:雌蟲尾部; I:雌蟲陰門A: Anterior end; B: Enlarged view of the excretory pore; C: Enlarged view of cervical papilla; D: Apical view of the head with four sub-median papillae and two amphids; E: Enlarged view of sub-median papillae; F: Enlarged view of amphids; G: Copulatory bursa of the male; H: Posterior end of the female; I: Female cunnus

雄蟲交合傘肋粗壯,生殖錐突出于交合傘之外,長約0.7 mm(0.65～0.75 mm),腹唇長于背唇,背唇距末端約100 μm(90～115 μm)處有突起(圖3G)。

雌蟲陰門開口近圓形,寬約26 μm(22～30 μm),距肛門約96 μm(85～105 μm),肛門開口弧形,長約98 μm(90～105 μm),尾長約208 μm(200～215 μm)(圖3H～3I)。

采集地點:烏克蘭

宿主:驢(Equusasinus)、斑馬(Equusburchelli)、普氏野馬(Equusprzewalskii)

3 討論

本試驗利用掃描電子顯微鏡首次對杯口屬和副杯口屬的3種線蟲的體表結構進行了比較觀察,杯口屬和副杯口屬線蟲在葉冠、蟲體大小和交合傘背肋的分裂方式上非常相似,其屬間與種間的形態學差別主要集中在頭端和生殖器,可通過口囊特征、內葉冠的插入方式和背肋的特點進行區分,在光學顯微鏡下很難對上述結構精確觀察,在掃描電子顯微鏡下外葉冠的形狀和數目、雄蟲交合傘的形狀、背肋的分列方式、生殖錐和雌蟲的尾部等結構辨識清晰、立體感強,可更簡單直觀地對杯口屬和副杯口屬進行區分,有利于精確鑒定線蟲的種類,結果表明,通過掃描電子顯微鏡觀察,能發現3種線蟲的外部形態特征有明顯的差異。

杯口屬的2個種的線蟲形態在光學顯微鏡下非常相似,通過掃描電子顯微鏡更易區分,不等齒杯口線蟲和拉氏杯口線蟲的主要區別是內、外葉冠的特征,本試驗不等齒杯口線蟲外葉冠數量為82枚,不同于張路平等[1]報道的76～80枚;拉氏杯口線蟲外葉冠數量為75枚,不同于Lichtenfels等[9]報道的60～70枚,與張路平等[5]報道的結果60～76枚相同。與前人光學顯微鏡下的觀察結果相比,掃描電子顯微鏡提供的數據更準確具體。不等齒杯口線蟲和拉氏杯口線蟲的生殖錐非常相似,在光學顯微鏡下很難發現區別,本試驗首次利用掃描電子顯微鏡發現其區別是不等齒杯口線蟲生殖錐皮質領缺乏,而拉氏杯口線蟲生殖錐皮質領在生殖錐兩側。不等齒杯口線蟲和拉氏杯口線蟲雌蟲尾長分別約為720 μm和470 μm,其比例約為2∶1,肛門開口長約為220 μm和245 μm,與張路平等[5]對上述結構的測量相比,使用電子掃描顯微鏡測量的結果精確度得到了大幅度提高。

本試驗測定的麥氏副杯口線蟲外葉冠數目為75枚,不同于Lichtenfels等[9]報道的60枚和張路平等[5]報道的62～68枚;雄蟲交合傘肋粗壯,生殖錐突出于交合傘之外,長約0.7 mm,背唇突起距末端約0.1 mm;雌蟲陰門與肛門距離較近,肛門開口較不等齒杯口線蟲和拉氏杯口線蟲小,約為98 μm;對上述結構詳細的觀察和測量尚屬首次。

終上所述,本試驗利用掃描電子顯微鏡對3種馬屬動物寄生線蟲進行了觀察,認為掃描電鏡圖譜辨識清晰,立體感強,更簡單直觀,擴大了不等齒杯口線蟲和麥氏副杯口線蟲外葉冠數目的區間,精確觀察了杯口屬雄蟲生殖錐的皮質領,增加了許多有意義的數據,為精確鑒定上述3種線蟲提供參考依據。