赤羽病病毒Gcaa465～704的桿狀病毒表達和單克隆抗體制備

魏 方,陳冬杰,鄧俊花,王晶晶,吳紹強

(中國檢驗檢疫科學(xué)研究院動物檢驗與檢疫研究所,北京 亦莊 100176)

赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)是引起反芻動物赤羽病 (Akabane disease,AKA) 的一種蟲媒病毒,主要通過庫蠓類吸血昆蟲叮咬進行傳播,廣泛分布于溫帶和熱帶地區(qū),包括澳大利亞、亞洲和非洲等地區(qū)。該病毒于1959年在日本群馬縣捕獲的蚊子中首次分離獲得[1]。反芻動物感染AKAV后可出現(xiàn)發(fā)熱、腹瀉、產(chǎn)奶量下降、流產(chǎn)死胎和新生牛羊先天性關(guān)節(jié)彎曲-積水性無腦綜合征(Congenital arthrogryposis hydraencephaly syndrome,AH)等[2],對發(fā)病地區(qū)的牛羊養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生了嚴(yán)重危害。

AKAV屬于布尼亞病毒科(Peribunyaviridae)正布尼亞病毒屬(Orthobunyavirus)辛布血清群(Simbu serogroup),是一種包膜病毒,含有3段負(fù)義單鏈RNA,即S、M和L;編碼6種蛋白,包括糖蛋白Gn和Gc、核衣殼蛋白N、非結(jié)構(gòu)蛋白NSs和NSm以及RNA依賴性RNA聚合酶[3]。正布尼亞病毒屬病毒的糖蛋白Gc是完整的跨膜蛋白,在病毒顆粒表面形成刺突,對病毒附著、膜融合和宿主免疫反應(yīng)具有重要意義[4]。研究證明,Gc蛋白N端可變部分具有高免疫原性,是中和抗體的主要靶標(biāo)[5]。為進一步研究Gc蛋白的生物學(xué)功能,本試驗通過昆蟲細胞桿狀病毒系統(tǒng)表達AKAV Gcaa465～704蛋白,在此基礎(chǔ)上利用雜交瘤技術(shù)制備針對Gcaa465～704蛋白的單克隆抗體,以期為研究AKAV Gc蛋白的功能提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 細胞和實驗動物 昆蟲卵巢細胞(SF21)、小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)和乳倉鼠腎細胞(Baby hamster syrian kidney,BHK21),均由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院動物檢驗與檢疫研究所保存;DH10Bac感受態(tài)細胞,購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。6～8周齡雌性BALB/c小鼠,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2021—0006]。

1.2 主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒,購自全式金生物技術(shù)有限公司;轉(zhuǎn)染試劑ExpiFectamineTMSf Transfection Reagent,購自Thermo Fisher公司;SIM SF昆蟲細胞培養(yǎng)基,購自Sino Biological公司;QuickAntibody-Mouse5W免疫佐劑和單抗亞類鑒定試劑盒,均購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司;慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside,X-Gal)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactoside,IPTG)、Anti-His Mouse mAb和HRP標(biāo)記的Goat Anti-Mouse IgG,均購自北京索萊寶科技有限公司;FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG,購自CST公司;Ni Sepharose 6 Fast Flow,購自GE Healthcare公司。

1.3 主要儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱,購自上海一恒科技有限公司;超聲波細胞粉碎機,購自寧波新芝生物科技股份有限公司;蛋白電泳儀,購自BIO-RAD公司;FluorChem R 多功能成像分析系統(tǒng),購自Proteinsimple公司;PCR儀、CO2培養(yǎng)箱和熒光顯微鏡,均購自Thermo Fisher公司。

1.4 重組桿粒的構(gòu)建和鑒定 因AKAV Gc蛋白全長含跨膜區(qū)不易表達,故本試驗選取AKAV Gc蛋白第465～704位氨基酸的基因序列[4],依據(jù)昆蟲細胞偏好進行密碼子優(yōu)化后,由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成至pFastBac HTB載體。將合成的重組質(zhì)粒pFastBacHis-Gcaa465～704轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細胞,在37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)4 h。取適量菌液涂布至含慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、X-Gal和IPTG的LB平板上,倒置于37 ℃培養(yǎng)箱,經(jīng)過連續(xù)2次藍白斑篩選后,挑取白色單菌落于含慶大霉素、卡那霉素和四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)后,使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組桿粒,利用通用引物M13F/R進行PCR鑒定,同時送北京擎科生物技術(shù)有限公司測序。將PCR鑒定為陽性且測序正確的重組桿粒命名為Bacmid-Gcaa465～704。

1.5 重組桿狀病毒的拯救 按照轉(zhuǎn)染試劑說明書操作,將重組桿粒Bacmid-Gcaa465～704轉(zhuǎn)染至SF21昆蟲細胞,置于28 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)約72 h,離心收集細胞培養(yǎng)上清,獲得第1代重組桿狀病毒液,即P1。用P1感染SF21昆蟲細胞,28 ℃條件下培養(yǎng)72 h后,在顯微鏡下觀察細胞形態(tài),離心收集細胞培養(yǎng)上清,獲得P2;以同樣的方法獲得第3代重組桿狀病毒液P3。

1.6 重組AKAV Gcaa465～704蛋白的表達、鑒定和純化 取適量P3重組桿狀病毒液感染SF21昆蟲細胞,28 ℃條件下懸浮培養(yǎng)72 h左右,分別收集細胞培養(yǎng)上清液和細胞。使用超聲破碎儀破碎細胞,分別收集破碎后的上清液和沉淀。將細胞培養(yǎng)上清液、細胞破碎上清液和細胞破碎沉淀進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)鑒定,觀察蛋白表達情況。然后用Ni親和層析填料純化重組AKAV Gcaa465～704蛋白,對純化后的蛋白進行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)至NC膜,用5%脫脂乳4 ℃過夜封閉,分別以Anti-His Mouse mAb為一抗,HRP標(biāo)記的Goat Anti-Mouse IgG為二抗,進行Western blot鑒定。

1.7 重組AKAV Gcaa465-704蛋白mAb的制備 參照QuickAntibody-Mouse5W免疫佐劑說明書,將佐劑與純化的AKAV Gcaa465～704蛋白按體積比1∶1迅速混勻,免疫小鼠。參照參考文獻[3]的方法篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗AKAV Gcaa465～704蛋白mAb的雜交瘤細胞。

1.8 mAb特性的鑒定 將表達純化的重組AKAV Gcaa465～704蛋白和重組施馬倫貝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)Gc蛋白進行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)至NC膜,用5%脫脂乳4 ℃過夜封閉,分別以篩選出的mAb雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液為一抗,HRP標(biāo)記的Goat Anti-Mouse IgG為二抗,進行Western blot鑒定。按照單抗亞類鑒定試劑盒說明書操作,對獲得的mAb進行亞型鑒定。

將AKAV感染BHK21細胞,培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基,使用預(yù)冷的無水乙醇固定細胞20 min,分別以篩選出的mAb雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液為一抗,FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗,進行間接免疫熒光試驗(Indirect immunofluorescence assay,IFA),在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 重組桿粒的鑒定 對獲得的重組桿粒進行PCR鑒定,結(jié)果顯示,目的條帶約位于3 000 bp處(圖1),與預(yù)期大小一致,且測序結(jié)果正確,表明成功構(gòu)建了AKAV-Gcaa465～704重組桿粒,將其命名為Bacmid-Gcaa465～704。

圖1 Bacmid-Gcaa465～704的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of Bacmid-Gcaa465-704M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1:Bacmid-Gcaa465～704的擴增產(chǎn)物M:DNA molecular weight Marker; 1:Amplification product of Bacmid-Gcaa465-704

2.2 重組桿狀病毒的拯救 用P1感染SF21昆蟲細胞,培養(yǎng)72 h后,顯微鏡下觀察可見,與正常SF21昆蟲細胞(圖2A)相比,感染的SF21昆蟲細胞發(fā)生明顯病變,即出現(xiàn)大量核胞體,細胞間隙增大,部分細胞變大失去光澤,甚至皺縮死亡(圖2B)。

圖2 顯微鏡觀察SF21昆蟲細胞形態(tài)Fig.2 Observation of SF21 insect cell morphology under microscopeA:正常的SF21昆蟲細胞; B:P1感染的SF21昆蟲細胞A:Normal SF21 insect cells; B:SF21 insect cells infected with P1

2.3 重組AKAV Gcaa465～704蛋白的表達、鑒定和純化 P3感染SF21昆蟲細胞72 h后的SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示,在相對分子質(zhì)量35 kDa處出現(xiàn)1條特異的染色條帶(圖3A),利用Ni親和層析填料純化,獲得純度達90%以上的目的蛋白(圖3B)。

圖3 重組AKAV Gcaa465～704蛋白的SDS-PAGE(A)和Western blot(B)鑒定Fig.3 Identification of recombinant AKAV Gcaa465-704 protein by SDS-PAGE (A) and Western blot (B) M:預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1:P3感染的SF21昆蟲細胞培養(yǎng)上清液; 2:P3感染的SF21昆蟲細胞破碎上清液; 3:P3感染的SF21昆蟲細胞破碎沉淀; 4:正常的SF21昆蟲細胞; 5、6:純化的AKAV Gcaa465～704蛋白M: Pre-stained protein molecular weight Marker; 1: Culture supernatant of SF21 insect cells infected with P3; 2: Lysis supernatant of SF21 insect cells infected with P3; 3: Lysis precipitate of SF21 insect cells infected with P3; 4: Normal SF21 insect cells; 5, 6: Purified AKAV Gcaa465-704 protein

2.4 mAb特性的鑒定 雜交瘤細胞經(jīng)篩選和亞克隆后,獲得1株穩(wěn)定分泌抗AKAV Gcaa465～704蛋白mAb的細胞株4D1,mAb重鏈為IgG1亞型,輕鏈為Igк型。通過Western blot驗證,mAb 4D1僅與AKAV Gcaa465～704蛋白反應(yīng),不與重組SBV Gc蛋白反應(yīng)(圖4),表明該單抗能夠特異性識別AKAV Gcaa465～704蛋白。

圖4 mAb 4D1的Western blot鑒定Fig.4 Western blot identification of mAb 4D11:AKAV Gcaa465～704蛋白; 2:SBV Gc蛋白1:AKAV Gcaa465-704protein; 2:SBV Gc protein

以mAb 4D1作為一抗進行IFA分析,AKAV感染的BHK21細胞出現(xiàn)特異性綠色熒光,而未感染的BHK21細胞沒有出現(xiàn)綠色熒光(圖5),表明mAb 4D1與AKAV感染的BHK21細胞發(fā)生特異性結(jié)合。

圖5 mAb 4D1的IFA鑒定Fig.5 IFA identification of mAb 4D1A:AKAV感染的BHK21細胞; B:正常的BHK21細胞A:BHK21 cells infected with AKAV; B:Normal BHK21 cells

3 討論

赤羽病作為一種可導(dǎo)致反芻動物繁殖障礙的蟲媒疫病,給流行區(qū)域和國家造成巨大的經(jīng)濟損失。隨著全球氣候變暖和全球貿(mào)易往來日益頻繁,該病傳播范圍逐漸擴大。相關(guān)研究人員已在我國部分地區(qū)的牛羊血清中檢測出AKAV中和抗體[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn),辛布血清群病毒在流行區(qū)域呈現(xiàn)血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)是常用的病毒檢測技術(shù)。對于成年反芻動物,病毒血癥通常在出一種循環(huán)流行的現(xiàn)象,即病毒季節(jié)性高發(fā)后零星散發(fā),這可能與宿主群體的整體免疫力和庫蠓屬昆蟲載體的豐度有關(guān)[6]。考慮到赤羽病對畜牧產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生的危害,做好該病的應(yīng)對措施和相應(yīng)檢測技術(shù)儲備具有重要意義。

AKAV感染后1～6 d發(fā)作,并僅能持續(xù)4～6 d[7],這導(dǎo)致直接病毒檢測以及后續(xù)PCR檢測和測序受到一定程度的限制。與之相比,抗辛布病毒抗體在感染后1～3周內(nèi)能夠被檢測到,并且在感染動物體內(nèi)持續(xù)存在長達2年之久[8,9],所以血清學(xué)檢測特異性抗體是一種更受歡迎的診斷方法。已有研究報道,在全病毒抗原和重組N蛋白基礎(chǔ)上建立的AKAV血清學(xué)檢測方法,由于N蛋白相對保守使得不同辛布血清群病毒之間易發(fā)生交叉反應(yīng),且抗N蛋白抗體沒有中和活性[10]。相反地,辛布血清群病毒Gc蛋白同源性較低[11],中和血清試驗顯示,抗糖蛋白中和抗體對特定病毒更具特異性[12]。Gc蛋白作為AKAV的中和抗原,一直受到研究人員的關(guān)注,研究發(fā)現(xiàn),其至少含有5個不同的抗原區(qū)[13]。王建華等[14]建立了一種基于重組截短Gcaa407-614的AKAV抗體間接ELISA檢測方法。Ogawa等[15]利用斑點印跡分析發(fā)現(xiàn),Gcaa1-97和Gcaa189-397區(qū)域包含中和位點。此外,研究顯示,正確的糖基化對Gc蛋白抗原性和免疫原性至關(guān)重要[16,17]。桿狀病毒表達系統(tǒng)是以昆蟲細胞為表達宿主建立的一種真核表達系統(tǒng),能夠?qū)λ磉_的外源蛋白進行翻譯后修飾,促進其正確折疊[18]。本試驗通過昆蟲細胞桿狀病毒系統(tǒng)截斷表達AKAV Gcaa465～704蛋白,將其純化后免疫小鼠,制備了1株可穩(wěn)定分泌抗AKAV Gcaa465～704蛋白mAb 的細胞株4D1,mAb重鏈為Ig G1亞型,輕鏈為Ig к型,能夠特異性識別AKAV Gcaa465～704蛋白,且可與AKAV感染的BHK21細胞發(fā)生反應(yīng)。本試驗表達的AKAV Gcaa465～704蛋白和制備的抗AKAV Gcaa465～704蛋白mAb 4D1為進一步研究開發(fā)AKAV診斷方法和分析Gc蛋白的功能提供技術(shù)支撐。