干酪乳桿菌SY13對小鼠免疫功能和腸道菌群的影響

賈震虎,楊云琪,王騰宇,逄曉陽,呂加平

(1.山西師范大學生命科學學院,山西 太原 030000 ; 2. 中國農業科學院農產品加工研究所,北京 海淀 100193)

干酪乳桿菌SY13(LactobacilluscaseiSY13) 屬于厚壁菌門乳桿菌屬,分離自我國牧區傳統發酵乳制品,前期研究表明,SY13作為兼性異型發酵乳酸菌,其活菌制劑能有效提高亞急性衰老小鼠的抗氧化能力,具有一定的延緩衰老作用,并且SY13和低聚糖組成的合生元可調節小鼠腸道內與肥胖和糖尿病代謝相關的嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila)的豐度,表明SY13具有潛在的抗氧化、降脂和降糖等功能[1-3]。但是,SY13活菌制劑口服劑量、口服時間和低聚糖種類都可影響其益生功能,相關機制有待深入研究。

研究表明,乳酸菌和特定寡糖益生元可通過調節腸道菌群結構,即增加腸道中有益菌、降低腸道中致病菌以改善腸道菌群失調,并可通過調節機體腸道致炎細胞因子和抗炎細胞因子的平衡,維持免疫穩態,在提高機體免疫的同時避免炎癥的發生,從而維護宿主健康[4-6]。因此,本試驗擬探究SY13是否可通過調節宿主免疫和腸道菌群來實現益生功能,從而進一步揭示其益生機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 低聚果糖和乳果糖,均購自上海源葉生物科技有限公司;血清白細胞介素-1β(Interleukin 1β,IL-1β)、IL-2、IL-4、IL-10和分泌型免疫球蛋白A(Secretory immunoglobulin A,sIgA)ELISA檢測試劑盒,均購自Sigma公司;TaqMan?Universal PCR Master Mix(4304437),購自美國應用生物系統中國公司;糞便基因組 DNA 提取試劑盒(DP328),購自天根生化科技有限公司。

1.2 主要儀器 多功能酶標儀(SPARK2M):帝肯(上海)貿易有限公司;熒光定量 PCR儀(7500):美國 ABI 公司;TP600型PCR儀:寶生物工程(大連) 有限公司。

1.3 試驗菌種和動物 干酪乳桿菌SY13:由中國農業科學院呂加平課題組分離自傳統乳制品;實驗動物:6周齡SPF級BALB/c雄性小鼠,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[生產許可證號:SCXK(京) 2016—0011]。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌液制備 將穩定期的SY13菌液于6 000 r/min離心10 min,收集菌體,無菌PBS洗滌2次,棄去上清液,用PBS懸浮并調節菌液濃度至109CFU/mL,取部分懸浮菌液,分別加入低聚果糖和乳果糖混勻,使SY13+低聚果糖和SY13+乳果糖的濃度為50 mg/mL,4 ℃保存備用。

1.4.2 試驗設計 小鼠飼養于中國農業大學動物醫學院實驗動物中心,環境溫度24 ℃,濕度40%～60%,光照12 h,試驗前先用標準飲食飼養7 d以適應環境。隨機將48只小鼠分為4個組,分別為無菌PBS組(BP1組)、SY13組(BP2組)、SY13+低聚果糖(15 mg/mL)組(BP3組)和SY13+乳果糖(15 mg/mL)組(BP4組)。每天12:00進行灌胃,灌胃體積為0.3 mL/只,連續灌胃28 d,分別于第1、3、5、7天時,每組取3只小鼠,摘眼球采集全血,分離血清并放入4 ℃冰箱備用;處死小鼠,分別取空腸、回腸、盲腸和結腸內容物,液氮保存備用。

1.4.3 血清sIgA和細胞因子定量檢測 取第1、3、5、7天采集的試驗各組小鼠血清樣本,采用ELISA試劑盒按說明書操作,檢測血清sIgA以及血清細胞因子IL-1β、IL-2、IL-4和IL-10的含量。

1.4.4 TaqMan-MGB 探針檢測腸道SY13含量 取第1天采集的試驗各組小鼠空腸、回腸、盲腸和結腸內容物,使用糞便基因組 DNA 提取試劑盒提取其基因組DNA,用探針Taqman-MGB(FAM-CTCAAAAATGGATCTTG-MGB)進行實時熒光定量PCR,檢測SY13含量。反應體系總體積20 μL:上游引物06232F(10 μmol)1 μL、下游引物06232R(10 μmol)1 μL、06232P(10 μmol)1 μL、模板DNA 1 μL、TaqMan?Universal PCR Master Mix 10 μL、滅菌超純水6 μL。反應條件:50 ℃酶激活2 min;95 ℃預變性10 min;循環階段,95 ℃變性15 s,58 ℃退火和延伸60 s,共40個循環;熒光檢測設定在退火和延伸階段。

1.4.5 腸道微生物多樣性檢測 取第1、7天采集的試驗各組小鼠盲腸內容物,進行腸道微生物多樣性檢測,利用PCR方法擴增細菌 16S rRNA 的V3和V4區中338～806 bp區域,上下游引物分別為 338F 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′,806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。將PCR產物構建測序文庫,由北京奧維森科技有限公司采用 Illumina Miseq平臺完成測序,分析小鼠腸道菌群α多樣性、Beta多樣性和腸道菌群結構[7]。

1.5 統計分析 試驗結果以“平均值±標準差”方式表示。采用SPSS 20.0軟件對所得數據進行統計分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清sIgA定量檢測 結果如表1所示,在第3天時,BP2組小鼠血清sIgA含量顯著高于其他各組 (P<0.05);在第7天時,BP1組小鼠血清sIgA含量顯著低于其他各組 (P<0.05)。

表1 各組小鼠血清sIgA含量Table 1 Serum sIgA level of mice in each group (pg/mL,n=3)

2.2 血清細胞因子定量檢測

2.2.1 IL-1β定量檢測 結果如表2所示,在第3天時,BP4組小鼠血清 IL-1β含量顯著高于其他各組 (P<0.05)。

表2 各組小鼠血清IL-1β含量Table 2 Serum IL-1β level of mice in each group (pg/mL,n=3)

2.2.2 IL-2定量檢測 結果如表3所示,在第1、5天時,BP2組小鼠血清IL-2含量顯著高于其他各組(P<0.05);在第7天時,BP2組和BP3組小鼠血清IL-2含量顯著低于BP1組和BP4組(P<0.05)。

表3 各組小鼠血清IL-2含量Table 3 Serum IL-2 level of mice in each group (pg/mL,n=3)

2.2.3 IL-4定量檢測 結果如表4所示,在第5天時,BP4組小鼠血清 IL-4含量顯著高于其他各組 (P<0.05)。

表4 各組小鼠血清IL-4含量Table 4 Serum IL-4 level of mice in each group (pg/mL,n=3)

2.2.4 IL-10定量檢測 結果如表5所示,在第3天時,BP2組、BP3組和BP4組小鼠血清 IL-10含量顯著高于BP1組 (P<0.05);而在第5天時,BP4組小鼠血清 IL-10含量顯著高于其他各組 (P<0.05)。

表5 各組小鼠血清IL-10含量Table 5 Serum IL-10 level of mice in each group (pg/mL,n=3)

2.3 TaqMan-MGB 探針檢測小鼠腸道SY13含量 結果如表6所示,BP1組小鼠腸道菌群中未檢測到SY13;BP4組小鼠空腸、回腸和盲腸菌群中SY13含量顯著高于其他各組 (P<0.05);BP3組和BP4組小鼠結腸菌群中的SY13含量顯著高于BP2組(P<0.05)。

表6 各組小鼠腸道菌群中SY13含量Table 6 Content of SY13 in the intestinal flora of mice in each group

2.4 小鼠腸道微生物多樣性分析 結果如表7所示,BP1組的Shannon、Ace指數和Chao 1均低于其他各組,表明SY13可以增加小鼠腸道的微生物豐富度。各組檢測覆蓋率達到約99%,表明當前測序量能夠覆蓋樣本中的絕大部分物種信息,可滿足后續生物信息學分析的要求。

2.5 腸道菌群群落組成分析 Beta多樣性分析表示不同分組條件下樣本之間微生物結構的相似性或差異性。聚類熱圖基于樣本屬水平分類,表示不同組間微生物結構的相似性或差異性。結果如圖1所示,各組小鼠盲腸菌群有部分聚類的趨勢,菌落能明顯區分開,但是均以擬桿菌門和厚壁菌門為主,說明各組有一定的同源性和相似性。

圖1 各組間共享屬聚類熱圖Fig.1 Heatmap of shared genus cluster among groupsD1:第1天; D7:第7天D1:Day 1; D7:Day 7

2.6 腸道菌群結構分析

2.6.1 菌群門水平分布 結果如表8所示,在第1、7天時,BP3組和BP4組小鼠盲腸菌群中的擬桿菌門豐度顯著高于BP1組(P<0.05);BP1組小鼠盲腸菌群中的變形菌門豐度顯著高于其他各組(P<0.05);BP3組小鼠盲腸菌群中厚壁菌門與擬桿菌門的豐度比值低于其他各組。

表8 干酪乳桿菌SY13對小鼠盲腸菌群門水平的影響Table 8 Effects of Lactobacillus casei SY13 on the phylum level of cecal flora in mice (%)

2.6.2 菌群屬水平分布 結果如表9所示,在第7天時,BP3組和BP4組小鼠盲腸菌群中另枝菌屬豐度顯著高于BP1組(P<0.05)。

表9 干酪乳桿菌SY13對小鼠盲腸菌群屬水平的影響Table 9 Effects of Lactobacillus casei SY13 on the genus level of cecal flora in mice (%)

3 討論

研究表明,宿主口服益生菌后,益生菌在腸上皮粘附和定植,可對宿主腸道上皮細胞發揮直接作用而調節免疫應答[8]。腸道微生物對益生元糖進行發酵可產生短鏈脂肪酸(Short-chain fatty acids,SCFAs),SCFAs 受體(G蛋白偶聯受體41和43)能結合至腸道相關淋巴組織(Gut-associated lymphoid tissue,GALT) 的免疫細胞,調控Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)或Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)信號通路,調節細胞因子表達,通過調節機體腸道致炎細胞因子和抗炎細胞因子的平衡,維持免疫穩態,在提高機體免疫的同時避免炎癥的發生[9,10]。細胞因子根據在炎性反應中的作用不同分為致炎細胞因子(IL-1、IL-2等) 和抗炎細胞因子(IL-4、IL-10等)。本試驗中BP2組小鼠血清IL-2含量在第3天時顯著升高,而后又逐漸降低,說明SY13前期在宿主腸黏膜腸道微生物定植和占位過程中誘發了炎性反應;第5天時BP4組小鼠血清IL-4和IL-10均顯著升高,表明SY13和乳果糖可調節小鼠血清抗炎細胞因子的表達,維持機體腸道致炎細胞因子和抗炎細胞因子的平衡,同時用TaqMan-MGB探針檢測到BP4組小鼠空腸、回腸和盲腸菌群中SY13含量顯著高于其他各組,表明長時間灌胃可使SY13在小鼠腸道中粘附和定殖,與Grattepanche等[11]和Zhang等[12]描述的益生菌在腸道內的分布是一致的。由于BP4組中給小鼠灌服的是SY13和乳果糖,說明乳果糖不僅有助于SY13在腸道粘附和定殖,并且可被腸道微生物發酵利用,產生的代謝產物可顯著調節宿主免疫功能。

研究表明,動物胃腸道內的微生物群中約90%屬于厚壁菌門和擬桿菌門,如果厚壁菌門與擬桿菌門比值逐漸增大,機體腸道微生物菌群的構成和多樣性將下降,導致胃腸道疾病多發[13],而益生菌能夠調控宿主腸道菌群恢復穩定狀態[14]。本試驗第1、7天時,BP3組和BP4組小鼠盲腸擬桿菌門菌群豐度顯著低于其他各組,BP3組小鼠盲腸厚壁菌門與擬桿菌門菌群的豐度比值低于其他各組,表明BP3組(SY13+低聚果糖)小鼠盲腸菌群豐富度增加,可降低宿主疾病感染概率。低聚果糖和乳果糖對于小鼠腸道不同的調節作用,表明不同益生元對益生菌的作用效果存在差異[15]。

腸道菌群物種分布相對豐度大于1%的微生物屬,在代謝-免疫關系網絡中發揮著重要的調控作用。瘤胃球菌屬菌群不僅可降解腸道內碳水化合物,而且與疾病相關[16,17];另枝菌屬菌群可以減緩腸道炎癥,提高宿主對碳水化合物的利用,增加體內脂肪的降解[18,19]。本試驗第7天時,BP3組和BP4組小鼠盲腸另枝菌屬菌群豐度顯著高于BP1組,表明低聚果糖和乳果糖可加強SY13對宿主代謝的調控,影響宿主腸道菌群和免疫。

本試驗結果表明,SY13可通過粘附和定殖腸黏膜調節小鼠免疫應答和腸道菌群,乳果糖不僅有助于SY13在腸道粘附和定殖,并且可被腸道微生物發酵利用,產生的代謝產物可顯著調節宿主免疫功能;低聚果糖可增加小鼠盲腸菌群豐富度,降低宿主感染疾病概率,可見不同益生元對益生菌的作用效果存在差異。