右美托咪啶對異氟烷誘導大鼠PC12細胞線粒體氧化損傷的影響

關佳佳,劉萌萌,于志勇,于權麟,王思爽,李繼文,遲 良,劉煥奇

(1. 青島農業大學動物醫學院,山東 青島 266109 ; 2. 青島市智慧鄉村發展服務中心,山東 青島 266100)

異氟烷(Isoflurance,ISO)是常用的吸入型揮發麻醉劑,主要用于全身麻醉的誘導和維持,研究顯示,異氟烷作用于發育期的腦組織可導致中樞神經系統受損,加劇某些神經退行性疾病的發生和機體的認知功能障礙[1]?；钚匝?Reactive oxygen species,ROS)主要在線粒體電子傳遞鏈由Ⅲ狀態向IV狀態轉換過程中產生。異氟烷可導致神經細胞產生大量的ROS,引起氧化損傷,導致細胞凋亡和神經功能退化[2]。從神經干細胞的產生到神經元的維持和最終的死亡,線粒體在調節神經通路的穩態中起著關鍵的作用,過量的ROS作用于線粒體,破壞線粒體結構,導致線粒體膜電位下降觸發線粒體凋亡信號通路,引起細胞凋亡[3,4]。因此,猜測異氟烷有可能通過產生過量的ROS誘導細胞氧化損傷來影響線粒體功能,從而引起細胞凋亡。

右美托咪啶(Dexmedetomidine,DEX)是一種α2-腎上腺素受體激動劑,可通過降低去甲腎上腺素的分泌,發揮鎮靜和鎮痛作用。研究發現,右美托咪啶與麻醉藥聯合使用可改善神經變性和長期認知功能損傷[5]。右美托咪啶具有抗氧化和清除氧自由基的能力,Wang等研究證實,右美托咪啶對利多卡因誘導的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(Pheochromocytoma-12 cell,PC12細胞)氧化損傷具有保護作用[6]。雖然有研究證明,右美托咪啶與麻醉藥合用可以有效降低麻醉藥所產生的術后認知功能障礙等相關并發癥[7]。然而,右美托咪啶在異氟烷誘發的細胞線粒體氧化損傷中的作用尚不清楚。因此,本試驗通過建立異氟烷誘導PC12細胞線粒體氧化損傷模型,探究右美托咪啶是否對異氟烷誘導的線粒體氧化損傷具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM高糖培養基,購自美國Cytiva公司;胎牛血清(Fetal bovin serum, FBS),購自賽默飛世爾科學(美國)科技有限公司;右美托咪啶(Dexmedetomid, DEX)、異氟烷(Isoflurane, ISO)、活性氧(Reactive oxygen species, ROS)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、過氧化氫酶(Catalase, CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPX)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒和線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1),均購自索萊寶生物科技有限公司;細胞色素C(Cytochrome C, Cyt-C)檢測試劑盒、Fura-2 AM熒光探針和TUNEL檢測試劑盒,均購自Abcam 生物有限公司。

1.2 主要儀器 Matrx小動物專用吸入麻醉機,購自美國MIDMARK公司;倒置顯微鏡,購自美國Scilogex公司;BILON-650Y型超聲波細胞破碎儀,購自韋克斯科技(北京)有限公司;超凈工作臺,購自賽默飛世爾科技有限公司;SPAVK型全波長酶標儀,購自上海帝肯貿易有限公司。

1.3 細胞株和細胞培養 PC12細胞,購自中國科學院細胞型培養庫(中國上海),使用含10% FBS的DMEM高糖培養基,37 ℃恒溫培養。

1.4 線粒體氧化損傷模型的建立和細胞分組 對照組(Control組)、右美托咪啶處理組(DEX組,25 μg/mL DEX預處理30 min)、異氟烷處理組(ISO組,細胞培養板置于特定的密閉容器中連接麻醉機,持續通入流量為2 L/min的氧氣,并通過吸入麻醉藥揮發罐給予2% ISO處理,持續作用4 h)以及右美托咪定和異氟烷共同處理組(DEX+ISO組,25 μg/mL DEX預處理30 min后通入2% ISO處理4 h)。本試驗所有試驗方法均設3組重復,進行數據統計分析。

1.5 試驗方法

1.5.1 細胞內ROS檢測 PC12細胞于6孔板中培養24 h,加藥處理,吸出舊培養液,PBS清洗3次,原位裝載DCFH-DA熒光探針,細胞培養箱37 ℃孵育20 min,無血清細胞培養液洗滌3次,熒光顯微鏡下觀察結果。

1.5.2 細胞內MDA、CAT、GPX和SOD檢測 PC12細胞于6孔板中培養24 h,加藥處理,1.5 mL離心管收集細胞,離心,棄上清,收集沉淀。向沉淀中加入1 mL PBS,清洗3次。加入1 mL PBS重懸細胞,使用超聲細胞破碎儀充分破碎細胞。根據MDA、CAT、GPX和SOD 測定試劑盒說明書中的反應體系和步驟操作進行檢測。

1.5.3 線粒體膜電位檢測 PC12細胞于6孔板中培養24 h,加藥處理,吸出舊培養液,PBS清洗3次,加入JC-1 染色工作液,充分混勻,細胞培養箱37 ℃孵育20 min,JC-1染色緩沖液洗滌2次,加入2 mL細胞培養液。通過熒光顯微鏡進行觀察和采集圖像,通過熒光的轉變分析線粒體膜電位的變化。

1.5.4 Cyt-C檢測 PC12細胞于96孔板中培養24 h,加藥處理,吸出舊培養液,PBS清洗2次,胰蛋白酶消化收集細胞于1.5 mL離心管中,離心棄上清,使用超聲波破碎儀充分破碎細胞,2 500 r/min離心20 min,收集上清。按照Cyt-C檢測試劑盒說明書步驟進行操作,以空白孔調零,于450 nm波長依序測量各孔的光密度(Optical density,OD)值。

1.5.5 細胞凋亡檢測 PC12細胞于96孔板中培養24 h,加藥處理,室溫下用含4%多聚甲醛的PBS溶液固定細胞30 min。除去固定液,添加通透劑(含0.2% Triton X-100的PBS溶液)室溫孵育30 min,BSA Working Solution洗滌細胞3次。參考TUNEL檢測試劑盒說明書配置TdT反應體系,加入50 μL反應混合物,37 ℃孵育60 min,PBS溶液洗滌3次,每次5 min。DAPI復染細胞核10 min,PBS洗滌3次,每次5 min,熒光顯微鏡下觀察結果。

1.5.6 細胞質Ca2+濃度檢測 PC12細胞接種至6孔板中培養24 h,加藥處理,PBS清洗3次,然后裝載 Fura-2 AM熒光分子探針,37 ℃ 孵育30 min,HBSS緩沖液清洗3次,熒光顯微鏡下觀察結果。

1.6 統計學分析 使用GraphPad Prism 7.04軟件進行數據統計分析和作圖,使用Image J 軟件對細胞熒光圖片進行定量分析,統計方法采用單因素方差分析,配合Tukey事后檢驗。試驗結果以“平均值±標準差”表示,以P<0.01 表示有極顯著性差異,以P<0.05表示有顯著性差異,以P>0.05表示無顯著性差異。

2 結果

2.1 右美托咪啶對異氟烷誘導PC12細胞氧化應激的影響 氧化應激相關指標檢測結果顯示,與Control組 (圖1A)相比,ISO組(圖1C)細胞綠色熒光明顯增多,而DEX組(圖1B)細胞綠色熒光基本一致,DEX+ISO組(圖1D)細胞綠色熒光較ISO組顯著減少。熒光定量分析結果顯示,與Control組相比,DEX組細胞ROS水平變化不顯著(P>0.05),而ISO組細胞ROS水平極顯著升高(P<0.01),右美托咪定能夠極顯著降低ISO引起的ROS水平上調(P<0.01)(圖2)。另外,與Control組相比,ISO組MDA(圖3A)含量極顯著升高(P<0.01),CAT(圖3B)、GPX(圖3C)和SOD(圖3D)酶活性極顯著降低(P<0.01),DEX對細胞MDA含量及CAT、GPX和SOD酶活性無顯著影響(P>0.05);而與ISO組相比,DEX+ISO組細胞內MDA含量極顯著降低(P<0.01),CAT和SOD酶活性極顯著升高(P<0.01),GPX酶活性極顯著升高(P<0.01)。結果表明,異氟烷可誘發PC12細胞氧化應激損傷,右美托咪啶對異氟烷誘導PC12細胞氧化應激具有保護作用。

圖1 右美托咪啶對異氟烷誘導PC12細胞ROS的影響Fig.1 Effect of dexmedetomidine on isoflurane induced ROS in PC12 cellsA:Control組; B:DEX組; C:ISO組; D:DEX+ ISO組A:Control group; B:DEX group; C:ISO group; D:DEX+ISO group

圖2 右美托咪啶對異氟烷誘導PC12細胞ROS影響的定量分析Fig.2 Quantitative analysis of the effect of dexmedetomidine on isoflurane induced ROS changes in PC12 cells與對照組比較,*:P<0.05,**:P<0.01; 與ISO組比較,#:P<0.05,##:P<0.01;下同Compared with the Control group,*:P<0.05,**:P<0.01; Compared with the ISO group,#:P<0.05,##:P<0.01.The same as blow

2.2 右美托咪啶對異氟烷誘導PC12細胞線粒體膜電位的影響 與Control組(圖4A)相比,DEX組(圖4B)細胞綠色熒光基本一致,ISO組(圖4C)細胞綠色熒光明顯增強;與ISO組相比,DEX+ISO組(圖4D)細胞綠色熒光顯著減少,紅色熒光恢復。熒光定量分析結果顯示,與Control組相比,ISO組細胞的線粒體膜電位極顯著降低(P<0.01),DEX組無顯著變化(P>0.05);而與ISO組相比,DEX+ISO組細胞的線粒體膜電位顯著升高(P<0.05)(圖5)。結果表明,右美托咪啶可以減輕異氟烷誘導的線粒體膜電位降低。

圖4 右美托咪啶對異氟烷誘導PC12細胞線粒體膜電位的影響Fig.4 Effect of dexmedetomidine on isoflurane induced mitochondrial membrane potential in PC12 cellsA:Control組; B:DEX組; C:ISO組; D:DEX+ISO組(紅色熒光:高膜電位; 綠色熒光:低膜電位)A:Control group; B:DEX group; C:ISO group; D:DEX+ISO group (Red fluorescence:High membrane potential; Green fluorescence:Low membrane potential)

圖5 右美托咪啶對異氟烷誘導PC12細胞線粒體膜電位影響的定量分析Fig.5 Quantitative analysis of the effect of dexmedetomidine on isoflurane induced mitochondrial membrane potential in PC12 cells

2.3 右美托咪啶對異氟烷誘導的PC12細胞Cyt-C濃度的影響 與Control組相比,ISO組細胞中Cyt-C濃度極顯著升高(P<0.01),DEX組細胞中Cyt-C濃度無顯著變化(P>0.05);而與ISO組相比,DEX+ISO組細胞中Cyt-C濃度顯著降低(P<0.05)(圖6)。結果表明,右美托咪啶可以降低異氟烷導致的Cyt-C濃度升高。

圖6 右美托咪啶對異氟烷誘導PC12細胞Cyt-C濃度的影響Fig.6 Effect of dexmedetomidine on isoflurane induced Cyt-C concentration in PC12 cells

2.4 右美托咪啶對異氟烷誘導PC12細胞細胞凋亡的影響 與Control組相比,ISO組細胞綠色熒光顯著增多,而DEX組細胞綠色熒光基本不變,提示異氟烷可誘導細胞凋亡;而與ISO組相比,DEX+ISO組細胞綠色熒光顯著減少(圖7)。熒光定量分析結果顯示,與Control組相比,DEX組綠色/藍色熒光強度比差異不顯著(P>0.05),ISO組綠色/藍色熒光強度比極顯著升高(P<0.01);而與ISO組相比,DEX+ISO組綠色/藍色熒光強度比極顯著降低(P<0.01)(圖8)。結果表明,右美托咪啶可以抑制異氟烷誘導的凋亡細胞。

圖7 右美托咪啶對異氟烷誘導PC12細胞細胞凋亡的影響(100×)Fig.7 Effect of dexmedetomidine on isoflurane induced apoptosis in PC12 cells (100×)

圖8 右美托咪啶對異氟烷誘導PC12細胞細胞凋亡影響的定量分析Fig.8 Quantitative analysis of the effect of dexmedetomidine on isoflurane induced apoptosis in PC12 cells

2.5 右美托咪啶對異氟烷誘導的PC12細胞胞質內Ca2+濃度的影響 與Control組(圖9A)相比,ISO組(圖9C)細胞綠色熒光顯著增強,而DEX組(圖9B)細胞綠色熒光基本一致;DEX+ISO組(圖9D)熒光較ISO組綠色熒光顯著減少。熒光定量分析結果顯示,與Control組相比,ISO組細胞胞質Ca2+濃度極顯著升高(P<0.01),DEX組無顯著變化;而與ISO組相比,DEX+ISO組細胞胞質Ca2+濃度顯著降低(P<0.05)(圖10)。結果表明,右美托咪啶可以降低異氟烷誘導的細胞胞質Ca2+濃度的增加。

圖9 右美托咪啶對異氟烷誘導PC12細胞細胞質中Ca2+濃度的影響Fig.9 Effect of dexmedetomidine on isoflurane induced cytoplasmic Ca2+concentration in PC12 cellsA:Control組; B:DEX組; C:ISO組; D:DEX + ISO組A:Control group; B:DEX group; C:ISO group; D:DEX + ISO group

圖10 右美托咪啶對異氟烷誘導PC12細胞細胞質中Ca2+濃度影響的定量分析Fig.10 Quantitative analysis of the effect of dexmedetomidine on isoflurane induced cytoplasmic Ca2+ concentration in PC12 cells

3 討論

研究表明,吸入麻醉劑異氟烷可誘導半胱天冬酶-3(Caspase-3)激活、β-淀粉樣肽(Amyloid peptide,Aβ)聚集增加、Tau蛋白磷酸化甚至引起認知功能障礙[8,9]。右美托咪啶主要用于全身麻醉的手術患者氣管插管和機械通氣時的鎮靜。研究發現,右美托咪啶與麻醉藥合用可以有效降低麻醉藥的使用劑量[10]。因此,本試驗選取右美托咪啶與異氟烷聯合用藥,通過建立PC12細胞氧化損傷模型,探究右美托咪啶對異氟烷誘導的線粒體氧化損傷的影響,為臨床安全使用異氟烷提供理論支持。

在離體研究中發現,異氟烷可以增加ROS水平,誘導線粒體功能障礙,降低ATP水平,導致認知功能障礙[11-15]。謝玉珍等[16]在評估不同麻醉對顱腦損傷老年患者氧化應激反應的影響時發現,異氟烷能顯著降低SOD和GPX的酶活性。本試驗結果顯示,PC12細胞經2%異氟烷刺激4 h后產生大量的ROS,說明異氟烷可誘導細胞內ROS大量聚集。同時本試驗也檢測了MDA、CAT、GPX和SOD等氧化應激相關指標,結果發現,ISO可上調PC12細胞MDA含量,降低抗氧化物酶CAT、GPX和SOD的酶活性,說明異氟烷可導致PC12細胞氧化損傷。而添加右美托咪啶后可提高CAT、GPX和SOD的酶活性并減少MDA含量。推斷右美托咪啶可以抑制PC12細胞ROS產生或激活抗氧化物酶活化的相關通路,發揮減輕氧化應激的作用,但仍需進一步試驗驗證。

線粒體跨膜通透性和線粒體膜電位與線粒體膜電位超微結構密切相關[17]。線粒體超微結構發生改變會導致ROS、凋亡相關蛋白Cyt-C、Apaf-1、Caspase-3和Caspase-9等的釋放,最終導致細胞凋亡。本試驗結果顯示,異氟烷處理可降低PC12細胞線粒體膜電位,說明異氟烷能導致線粒體功能紊亂,而添加右美托咪啶能穩定線粒體膜電位,減少異氟烷導致的線粒體功能紊亂。已有研究顯示,異氟烷可能通過提高胞質鈣水平來誘導細胞凋亡[18]。本試驗結果顯示,異氟烷處理上調了細胞胞質內的Ca2+、Cyt-C的表達并導致凋亡細胞數目的增加,說明異氟烷造成細胞線粒體功能障礙和細胞凋亡,而添加了右美托咪啶處理后可逆轉上述結果。

綜上所述,本試驗采用PC12細胞作為研究對象,通過檢測氧化應激指標,ROS水平、線粒體膜電位、細胞質內Ca2+濃度、促凋亡因子Cyt-C和細胞凋亡,證實右美托咪啶可通過減少ROS釋放、穩定線粒體膜電位、降低Ca2+濃度,減少Cyt-C釋放和抑制細胞凋亡來減輕異氟烷誘導的線粒體功能障礙。本試驗為進一步闡述右美托咪啶對異氟烷誘導的線粒體功能障礙的保護作用機理的相關研究提供數據支持。