冷暴露對內毒素性急性肺損傷小鼠TLR4信號通路的影響

齊佳悅,李 妍,吳明達,馮憲敏,萬 朋,駱曉峰,朱文赫,呂士杰,謝 維,高俊濤

(1.吉林醫藥學院附屬醫院,吉林 吉林 132013 ; 2. 吉林醫藥學院基礎醫學院,吉林 吉林 132013)

急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)是由多種因素(包括創傷、肺炎、休克和敗血癥等)引起的急性的、危及生命的疾病,是臨床上發病率和死亡率極高的疾病[1,2]。ALI的特點是過度的炎癥反應,中性粒細胞過度浸潤,肺組織釋放促炎細胞因子,肺泡毛細血管內皮細胞和上皮細胞損傷,引起水腫和氣體交換異常[3-5]。引起ALI的一個主要原因是內毒素血癥和細胞毒性途徑激活,導致急性呼吸窘迫,最終引發多器官功能障礙綜合征[6]。急性肺損傷通常較早發生并迅速發展,這是敗血癥患者最直接的死亡原因之一[7,8]。炎癥被認為是急性肺損傷發生的誘因[9]。雖然環境低溫與呼吸道感染易感性之間的關系已被普遍接受,但環境低溫對肺部反應性炎癥的影響,冷應激與肺部炎癥嚴重程度之間的關系及其可能機制尚未得到充分研究。本試驗旨在為冷暴露與肺功能的關系提供新的理論依據,同時為抗低溫機制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),購自美國Sigma公司;Mouse IL-6 ELISA試劑盒和Mouse TNF-α ELISA試劑盒,均購自英國Abcam公司;Anti-GAPDH抗體和Anti-TLR4抗體,均購自美國Cell Signaling Technology公司;RAPI 組織和細胞裂解液,均購自北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒,購自碧云天生物技術有限公司;聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluorid,PVDF)膜,購自美國Millpore公司。

1.2 主要儀器 電子天平,德國Sartorius公司產品;Pathological切片機,德國孚光精儀有限公司產品;旋渦混勻器,中國常州恩培儀器制造有限公司產品;TGL-16M 高速臺式冷凍離心機,中國上海盧湘儀離心機廠產品;倒置顯微鏡,日本 OLYMPUS公司產品;化學發光成像系統,中國上海勤翔科學儀器有限公司產品。

1.3 實驗動物分組和處理 選用40只清潔級健康BALB/c雄性小鼠[購自吉林大學實驗動物中心,生產許可證號:SCXK(吉)2017—0007],體重35～40 g,動物試驗經吉林醫藥學院倫理委員會批準(批準號:20170716)。將40只小鼠隨機分為正常對照組(Normal control group,N組)、LPS組(Lipopolysaccharide group,L組)、冷暴露組(Cold exposure group,C組)和冷暴露+LPS 組(Cold exposure+Lipopolysaccharide group,C+L組),每組10只,其中L組和C+L組小鼠按0.5 mg/(kg·bw)鼻滴LPS,NS組和C組鼻滴等體積無菌PBS溶液,滴鼻后將C組和L組小鼠置于室溫環境下,C組和C+L組小鼠置于(4±2)℃通風冷室,6 h后檢測各項指標。

1.4 支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中總蛋白濃度和白細胞數量檢測 將各組小鼠使用乙醚進行麻醉,麻醉后的小鼠沿中線行氣管切開術,然后將1 mL無菌注射器與無菌槍頭連接(保持連接處密封),將500 mL PBS緩緩推入氣管內,然后吸出,連續重復操作3次,合并3次收集的BALF。收集的BALF于4 ℃、3 000 r/min離心5 min,取上清液。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測各組BALF上清液中的總蛋白濃度,具體操作嚴格按照試劑盒說明書步驟要求進行。將剩余沉淀中加入200 mL 紅細胞裂解液,1 min后加入1 mL PBS,3 000 r/min離心3 min,棄上清(如果沉淀的紅色很明顯,可以重復以上操作),沉淀用 100 mL PBS重懸,取10 mL重懸液使用計數板計數白細胞。

1.5 BALF中促炎細胞因子TNF-α和IL-6含量檢測 BALF上清液獲取方法同1.4,采用酶聯免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測定BALF中 TNF-α和IL-6含量,具體操作嚴格按照試劑盒說明書步驟進行。

1.6 肺組織的濕干重比(Wet to dry weight ratio,W/D)檢測 取小鼠左肺并用濾紙吸干其表面水分,電子天平精確稱重,記錄為濕重。然后將肺組織置于56 ℃烘箱中,3次稱量恒重后,記錄為干重,計算肺組織W/D,用以反映肺組織的水腫程度。

1.7 肺組織的組織病理學觀察 肉眼觀察各組肺組織水腫和出血點等變化,取右肺中葉,置于4%中性甲醛固定,常規石蠟包埋和切片,蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,H.E.)染色,置于光學顯微鏡下觀察肺組織的組織病理學變化。

1.8 肺組織中Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)蛋白表達量檢測 采用 Western blot法檢測小鼠肺組織中TLR4蛋白的相對表達量。于冰上取小鼠肺組織,剪碎后加入組織蛋白裂解液研磨,冰浴裂解 30 min,11 500 r/min(4 ℃,離心半徑12 cm)離心20 min,吸取上清蛋白液,BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。取40 mg蛋白樣品經12% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離后轉移至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的吐溫-三羥甲基氨甲烷緩沖鹽溶液(Tris buffer saline with tween,TBST)封閉2 h,加入相應一抗4 ℃孵育過夜。洗去多余一抗,將PVDF膜浸泡于辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)標記的二抗孵育液中,37 ℃搖床孵育2 h。使用電化學發光(Enhanced chemiluminescence,ECL)底物液進行化學發光顯影,通過Image-ProPlus測量蛋白條帶的光密度。

1.9 統計分析 試驗結果以“平均值±標準差(Mean±SD)”方式表示。采用 SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析,使用單因素方差分析法進行差異顯著性檢驗。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 各組小鼠BALF中總蛋白濃度和白細胞數量比較 與N組比較,C組總蛋白濃度和白細胞數量無統計學差異(P>0.05),L組和C+L組總蛋白濃度和白細胞數量均極顯著升高(P<0.01);與C組比較,C+L組總蛋白濃度和白細胞數量均極顯著升高(P<0.01);與L組比較,C+L組總蛋白濃度和白細胞數量均明顯升高(P<0.05)(表1)。

2.2 各組小鼠BALF中TNF-α和IL-6含量比較 與N組比較,C組TNF-α和IL-6無統計學差異(P>0.05),L組和C+L組TNF-α和IL-6含量均極顯著升高(P<0.01);與C組比較,C+L組TNF-α和IL-6含量均極顯著升高(P<0.01);與L組比較,C+L組TNF-α和IL-6含量均明顯升高(P<0.05)(表2)。

表2 各組小鼠BALF中TNF-α和IL-6含量比較Table 2 Comparison of TNF-α and IL-6 level in BALF of mice in each group (pg/mL,n=10)

2.3 各組小鼠肺組織W/D比較 與N組比較,C組肺組織W/D無統計學差異(P>0.05),L組和C+L組肺組織W/D均明顯升高(P<0.05);與C組比較,C+L組肺組織W/D明顯升高(P<0.05);與L組比較,C+L組肺組織W/D明顯升高(P<0.05)(表3)。

表3 各組小鼠肺組織W/D比較Table 3 Comparison of lung W/D of mice in each group (n=10)

2.4 各組小鼠肺組織的組織病理學觀察 與N組比較,C組H.E.染色結果正常,兩者沒有明顯的差異,L組和C+L組肺組織發生組織病理學改變;與C組比較,C+L組出現了炎性細胞浸潤、肺水腫、肺泡出血和肺泡間隔增厚,肺泡結構受損的情況;與L組比較,C+L組肺損傷更為嚴重(圖1)。

圖1 各組小鼠肺組織的組織病理學觀察(H.E.染色,200×)Fig.1 Histopathological observation of lung tissues of mice in each group(H.E.staining,200×)A:正常對照組; B:冷暴露組; C:LPS組; D:冷暴露+LPS組(a:炎性細胞浸潤; b:肺泡間隔增厚; c:肺水腫; d:肺泡出血)A:Normal control group; B:Cold exposure group; C:LPS group; D:Cold exposure+LPS group(a:Inflammatory cell infiltration; b:Alveolar septal thickening; c:Pulmonary edema; d:Alveolar hemorrhage)

2.5 各組小鼠肺組織中TLR4蛋白表達量比較 與N組比較,C組肺組織中TLR4蛋白表達量無統計學差異(P>0.05),L組和C+L組肺組織中TLR4蛋白表達量均明顯升高(P<0.05);與C組比較,C+L組肺組織中TLR4蛋白表達量極顯著升高(P<0.01);與L組比較,C+L組肺組織中TLR4蛋白表達量明顯升高(P<0.05)(圖2和表4)。

圖2 各組小鼠肺組織TLR4蛋白表達水平Fig.2 Expression levels of TLR4 protein in lung tissues of mice in each group

表4 各組小鼠肺組織TLR4蛋白表達量比較Table 4 Comparison of TLR4 protein expression in lung tissue of mice in each group (n=5)

3 討論

ALI可導致炎癥介質大量合成和釋放,最終造成肺實質性損傷。BALF中炎癥因子的水平,如TNF-α和IL-6等促炎因子的釋放,是評價肺部炎癥反應程度的重要標志[10,11]。TNF-α是ALI最重要的啟動因子之一,能夠刺激肺組織中氧自由基和蛋白溶解酶的大量合成和釋放,并可誘導中性粒細胞在肺內聚集和粘附,導致肺泡和毛細血管損傷,故其可反映肺組織損傷的嚴重程度[12-14]。IL-6是強有力的促炎細胞因子,能夠放大肺部的炎癥反應[15-17]。冷暴露會加重LPS誘導的肺損傷程度。

促炎反應在急性肺損傷發生過程中的重要性毋庸置疑。LPS 誘導促炎細胞因子產生,如TNF-α和IL-6等表達水平的激增,這可能使得中性粒細胞滲入到肺組織中,啟動局部炎癥反應。肺泡-毛細血管屏障因中性粒細胞的過度積累遭到破壞,使得毛細血管的通透性增加,從而使富含蛋白質的液體進入支氣管血管周圍間質,導致肺水腫。另外,白細胞在急性肺損傷的發病過程中也起著尤為重要的作用,其能引發炎癥,參與形成肺損傷。本試驗結果顯示,小鼠BALF中總蛋白濃度、白細胞數量以及肺組織W/D在LPS刺激后顯著上升,其中C+LPS組上升更加顯著,肺組織H.E.染色的結果也驗證了以上說法,說明冷暴露加重了小鼠肺損傷的程度。

ALI導致肺部發生炎癥期間,氣道上皮細胞(Airway epithelial cells,AECs)廣泛表達不同Toll樣受體,包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6(細胞外TLRs)以及TLR3、TLR7、TLR8和TLR9(細胞內TLRs)[18-20],從而激活下游信號通路。其中,關于TLR4的研究結果與本試驗結果一致。本試驗中,與正常對照組比較,LPS組TLR4蛋白表達量顯著增加;與LPS組比較,冷暴露+LPS組TLR4蛋白表達量顯著增加。組織病理學檢測結果顯示,冷暴露組已經出現炎癥細胞浸潤,LPS組出現肺泡間隔增厚和炎癥細胞浸潤,而冷暴露+LPS組中出現更為嚴重的肺泡間隔增厚和炎癥細胞浸潤,直至出現肺水腫和肺泡出血的嚴重病理改變,表明冷暴露加重了LPS誘導肺損傷的損傷程度。上述結果說明,TLR4參與了ALI的發展過程,冷暴露可能通過TLR4信號通路了加重LPS誘導的小鼠肺損傷。

TLR4信號傳導與ALI產生的先天免疫和急性炎癥有關[21]。LPS作為一種有效的炎癥細胞毒性誘導劑,可能對包括心臟、肝臟、脾臟和肺臟在內的器官造成很多損害[22,23]。研究表明,TLR4是參與LPS誘導炎癥反應的主要調節因子,其中TLR4作為LPS受體在ALI的發生發展過程中起主要作用[24],可促使肺損傷進一步加重。本試驗中冷暴露加重了急性肺損傷的程度,而且提高了TLR4表達,由此可見,冷暴露加重LPS誘導的肺損傷程度與TLR信號通路密切相關。