淫羊藿苷抑制Notch信號通路促進骨髓間充質干細胞分化研究

摘 要：為了研究淫羊藿苷（ICA）抑制Notch信號通路對骨髓間充質干細胞（BMSCs）成骨分化。選取8周齡SPF級健康雌性大鼠40只，手術摘除雙側卵巢建立大鼠骨質疏松癥模型。收集BMSCs細胞進行體外分離培養，取傳代第三代細胞進行鑒定，試驗組加入濃度為0.8 g/100 mL ICA，對照組加入同劑量的雌激素，對細胞進行培養。收集培育的細胞上清液，檢測堿性磷酸酶（ALP）和骨鈣素（OCN）水平及Notch信號通路中相關蛋白Notch1、Jagged-1、CBF1的表達水平。結果表明，流式細胞檢測P3代骨髓間充質干細胞表面抗原，CD90、CD44、CD34、CD11陽性率分別為98.2%，93.3%，2.6%，4.4%，確認細胞鑒定為骨髓干細胞。與對照組比較，試驗組ALP和OCN活性明顯升高、另外Noth1、CBF1、Jagged-1蛋白表達量均較對照組降低。淫羊藿苷通過上調ALP和OCN水平及抑制Notch通路中Notch1、CBF1、Jagged-1蛋白的表達，實現對去卵巢骨質疏松癥大鼠BMSCs的增殖和成骨細胞分化。

關鍵詞：淫羊藿苷；骨質疏松癥；骨髓間充質干細胞（BMSCs）；Notch信號通路；成骨分化

中圖分類號：R285" " 文獻標識碼：A 文章編號：1674-0033（2024）04-0070-06

引用格式：周亞妮，張曉文，王丹.淫羊藿苷抑制Notch信號通路促進骨髓間充質干細胞分化研究[J].商洛學院學報，2024，38（4）：70-75.

A Study on Icariin Inhibiting Notch Signaling Pathway and Promoting Differentiation of Bone Marrow

Mesenchymal Stem Cells

ZHOU Ya-ni， ZHANG Xiao-wen， WANG Dan

（College of Health Management， Shangluo University， Shangluo" 726000， Shaanxi）

Abstract： To study the effect of icariin （ICA） on the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） by inhibiting Notch signaling pathway， a total of 40 8-week-old SPF healthy female rats were selected and bilateral ovaries were surgically removed to establish an osteoporosis model. BMSCs were isolated and cultured in vitro， and the third generation cells were identified. The experimental group was treated with 0.8 g/100 mL ICA. The supernatant of cultured cells was collected to detect the levels of alkaline phosphatase （ALP）， osteocalcin （OCN） and Notch signaling pathway-related proteins Notch1， Jagged-1 and CBF1. The results showed that the positive rates of CD90， CD44， CD34 and CD11 were 98.2%， 93.3%， 2.6% and 4.4%， respectively， and the cells were identified as bone marrow stem cells. Compared with the control group， the ALP and OCN activity of the experimental group was significantly increased， and the protein expression of Noth1， CBF1 and Jagged-1 was decreased.Icariin can promote the proliferation and osteogenic differentiation of BMSCs in ovariectomized osteoporosis rats by upregulating the levels of ALP and OCN and inhibiting the expression of Notch1， CBF1， and Jagged-1 proteins in the Notch pathway.

Key words： icariin; osteoporosis; bone marrow meservchymal stem cells （BMSCs）; Notch signaling pathway; osteogenic differentiation

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種慢性代謝性疾病，臨床上主要表現為骨量丟失與降低、骨組織微結構破壞及骨脆性增加。骨質疏松癥各年齡段均可發病，導致骨骼脆性增加和易發生骨折，常見于老年人，尤其是絕經后的女性，其發病率居所有代謝性骨病的首位，嚴重危害了中老年人的身心健康。其中，絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）占骨質疏松癥的一半以上，絕經是引起女性骨質疏松癥的危險因素[1]。伴隨著全球老齡化的加劇，骨質疏松癥已成為全球性公共衛生問題，探尋防治骨質疏松癥靶點明確的特效藥和探究其作用機制成為亟待解決的醫學難題[2]。淫羊藿苷（icariin，ICA）是淫羊藿中的主要活性成分，有研究表明淫羊藿苷可促進雌激素合成，具有雌激素樣作用，且不良反應小，在促進動物骨向分化能力等方面有重要作用[3-5]。骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種具有多功能分化的細胞，可分化為骨細胞、成骨細胞和軟骨細胞等，研究表明骨髓間充質干細胞分化可能是決定骨組織結構的關鍵因素[6]。已有研究表明，幾乎所有細胞的增殖、分化和凋亡都涉及Notch信號通路的調控，骨髓間充質干細胞中有Notch1通路存在，Notch通路在調控骨髓間充質干細胞骨向分化中發揮重要作用，可能是骨再生與修復的重要靶點[7-11]。杜紅陽等[12]研究表明，在地黃的作用下，正常擴增的骨髓間充質干細胞中出現Notch1蛋白的高表達，Notch1蛋白、Jagged1蛋白和CBF1蛋白表達明顯降低。目前，關于淫羊藿苷參與Notch信號通路促進骨髓間充質干細胞骨向分化的研究較少。本文以動物骨質疏松癥模型的體外試驗為基礎，探討淫羊藿苷對Notch信號通路中幾個關鍵靶點的影響，通過闡明骨髓間充質干細胞骨向分化作用，為淫羊藿苷應用于臨床骨質疏松癥的治療提供參考。

1" 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試動物

選取SPF級飼養的健康雌性SD大鼠40只，8周齡，體重200～240 g，購自西安交通大學醫學部實驗動物中心，許可證號[SCXK（陜）2018-001]。飼養房控制溫度為24～25 ℃，相對濕度為45%～55%，每8～10 h換氣一次，光暗周期為12 h/12 h。

1.1.2試劑、藥物與儀器

堿性磷酸酶（ALP）活性檢測試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號：BC2162）、大鼠骨鈣素（OCN）活性檢測試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號：E30602）、兔抗鼠Notch1單克隆抗體（葛蘭素史克醫藥公司，批號：ab61537）、Jagged1單克隆抗體（葛蘭素史克醫藥公司，批號：ab10264）、CBF1單克隆抗體（葛蘭素史克醫藥公司，批號：ab12178）、DMSO（Sigma，美國）、ICA純度gt;98.0%（陜西省中醫藥研究院，藥品批號：220324-201010）、青霉素（西安利君制藥廠，藥品批號：B20190814，規格：80萬單位）、流式細胞儀（BD，美國）、二氧化碳恒溫培養箱（Thermo，美國）、全自動酶標儀（上海博谷生物科技有限公司）、分光光度計、電子天平均為西安市光華分析儀器廠、微量移液器（上海市求精儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1骨質疏松癥模型建立

根據相關造模方法[13-14]，大鼠禁食6 h后，取氯胺酮（純藥含量為100 g/2 mL），按照0.1 mL/100 g劑量，采用肌肉注射法麻醉。在下腹正中常規除毛消毒后，橫行切開皮膚，入腹腔，游離脂肪層，依次暴露各層組織，找到卵巢，結扎并切除卵巢，逐層縫合。術后給1.5 mL/kg的劑量注射青霉素，連用3 d，以預防術后感染。模型組取陰道上皮角化細胞，做瑞氏染色法，確定建模成功。

1.2.2傳代骨髓間充質干細胞的分離培養及形態學觀察

參照蒲曉姝等[15]的方法，頸椎脫臼處死大鼠，在醫用酒精中浸泡10 min，用消毒器械剔除大鼠皮膚肌肉組織，取其股骨和脛骨浸泡于含雙抗的PBS中，暴露骨髓腔，處理干凈干骺端，無菌操作剪斷股骨和脛骨，置于2%胎牛血清的DMEM培養基中反復吹打，直至骨髓被全部沖出，得到懸液，貼壁倒入離心管中，以2 000 r/min離心10 min棄上清，接種于培養瓶置37 ℃，5% CO2恒溫培養箱，標記為原代細胞。首次1 d換培養液一次，以后每2 d更換培養液一次。待原代細胞生長密度達90%以上時，首次取生長優越的細胞按1：2 比例傳代培養得第一代骨髓間充質干細胞（P1代細胞），同樣方法得第二代骨髓間充質干細胞（P2代細胞）、第三代骨髓間充質干細胞（P3代細胞）。用倒置顯微鏡觀察各形態。

1.2.3成骨誘導骨髓間充質干細胞表面標志物鑒定

選取P3代細胞，調整細胞濃度為1×106 CFU/mL，

分別加入兔抗鼠CD11（anti-rat CD11）、兔抗鼠CD90（anti-rat CD90）、兔抗鼠CD44（anti-rat CD44）、兔抗鼠CD34（anti-rat CD34），流式細胞術檢測，樣本按1×104個細胞/份收集，用Flow Jo10軟件計進行分析。

1.2.4誘導后的骨髓間充質干細胞增殖的檢測

參考劉飛祥等[16]的方法，采用CCK-8法檢測誘導后BMSCs的增殖，繪制生長曲線。取指數生長期的P3代細胞，按照每孔1×104個細胞密度接種于6塊96孔板中，試驗組和對照組1～10 d共計10 d，每天加入CCK-8試劑，孵育1 h后，將96孔板放入酶標儀中，以最佳波長為450 nm時進行檢測。試驗重復3次，取其均值并繪制細胞生長曲線。

1.2.5藥物干預措施及含藥血清的制備

將培養好的P3代細胞濃度為1×105 CFU/mL

接種于24孔培養板中，分為對照組與試驗組。根據本課題組前期研究，利用不同濃度的淫羊藿苷與雌激素作為對照，得出濃度為0.8 g/100 mL的ICA是促進骨髓間充質干細胞骨向分化能力的最佳濃度[17]。本研究中，對照組加入含DMSO的DMEM培養基，試驗組設定ICA濃度為0.8 g/100 mL，對細胞進行培養。收集培養0～10 d后的細胞上清液，置于超低溫冰箱保存，待測。

1.2.6成骨標志物堿性磷酸酶和骨鈣素水平的檢測

采用ELISA法檢測成骨標志物堿性磷酸酶和骨鈣素水平。取培養7 d后的P3代細胞，置于4 ℃溫度的PBS液封閉30 min。以1 000 r/min離心10 min。參照試劑說明，利用比色法檢測堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和骨鈣素（osteocalcin，OCN）水平。

1.2.7Notch通路相關蛋白（Notch1、Jagged-1、CBF1蛋白）的表達水平的檢測

采用Western bloting法檢測Notch通路相關蛋白（Notch1、Jagged-1、CBF1蛋白）的表達水平。將BMSCs細胞培養10 d后，利用D-Hanks溶液清洗細胞，加入蛋白裂解液，在4 ℃下保持30 min后，再以1 500 r/min離心10 min，濾掉細胞碎渣，保留上清液，用BCA法測蛋白濃度。通轉膜、清洗等，然后加入一抗稀釋液（分別含Notch1、Jagged-1、CBF1）置于4 °C 冰箱孵育過夜，再加入PBS溶液，置于搖床上，65 r/min，清洗3次，每次10 min，加二抗稀釋液，室溫孵育1 h，加入PBS液清洗3次。3 min后在暗室中進行曝光顯影、保存圖片，備用。

1.3 統計學處理

計量資料用均值±標準差（x±s）表示，運用SPSS20.0 軟件進行統計分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗。Plt;0.05，認為有統計學意義。

2" 結果與分析

2.1 大鼠骨髓間充質干細胞體外培養及形態學觀察

將細胞置于37 ℃，5%CO2 的孵箱培養2 d后，首次換掉一半液體，得到P1代細胞，在倒置顯微鏡下可見貼壁細胞較少且形成集落，伸出偽足呈逗點狀或短棒狀，有少量多形性細胞，部分雜質細胞呈類圓形，如圖1（a）所示。培養4 d后，得到P2代細胞，可見細胞形狀拉長，梭形細胞較P1代增多，胞核為橢圓形，核仁清晰，伸出長短不一的突起，貼壁較好，成堆出現，如圖1（b）所示。培養7 d后，得到P3代細胞，可見大量長梭形細胞長滿培養皿底部，胞核為卵圓形，細胞間排列更為緊密，形成單層，如圖1（c）所示。

2.2 大鼠骨髓間充質干細胞純度的鑒定

流式細胞檢測P3代骨髓間充質干細胞表面抗原，結果如圖2所示，CD90、CD44、CD34、CD11陽性率分別為98.2%，93.3%，2.6%，4.4%。由此可見，CD44、CD90為陽性，CD34、CD11為陰性，從而與造血干細胞相鑒別。

2.3 淫羊藿苷對去卵巢大鼠骨髓間充質干細胞的影響

2.3.1淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞生長的影響

由圖3可見，試驗組骨髓間充質干細胞增長趨勢呈S形，第3～6 天生長最為快速，第6天到達最高峰。對照組細胞繼續生長，但生長趨勢并不明顯。第6天后試驗組細胞數量明顯大于對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05）。

2.3.2淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞成骨誘導后堿性磷酸酶和骨鈣素活性的影響

如圖4（a）所示，在淫羊藿苷作用下，試驗組較對照組的堿性磷酸酶活性明顯增高，差異有統計學意義（Plt;0.05）。如圖4（b）所示，與對照組比較，試驗組骨鈣素活性水平明顯高于對照組（Plt;0.05）。以上兩項均表明淫羊藿苷具有明顯促進促進骨髓間充質干細胞成骨分化能力。

2.3.3淫羊藿苷對Notch信號通路相關蛋白質表達的影響

運用West blot法檢測淫羊藿苷對大鼠骨髓間充質干細胞中Notch信號通路相關蛋白表達，檢測結果如圖5所示，與對照組比較，試驗組Noth1、Jagged-1、CBF1蛋白表達均有所降低，差異有統計學意義（Plt;0.05）。

3" 討論與結論

骨質疏松癥是中老年人的常見病和多發病，絕經后骨質疏松癥是最為常見的一種。研究表明，由于女性絕經后雌激素水平驟然下降，絕經后骨質疏松癥可引發脂代謝及骨代謝紊亂[18]。另有動物研究表明，雌激素缺乏和脂代謝異常會導致骨髓微環境異常，脂肪細胞會影響骨髓間充質干細胞的增殖和分化，雌激素是骨質疏松骨修復的主要來源[19]。骨髓間充質干細胞是細胞治療及組織工程最為理想的細胞，臨床上骨髓間充質干細胞用于治療一些骨損傷疾病有較好的前景[20]。本研究采用去卵巢法建立大鼠骨質疏松模型，模擬絕經后骨質疏松癥，觀察骨髓間充質干細胞的生長，體外培養中取生長良好的P3代細胞，研究發現去卵巢骨質疏松大鼠的骨髓間充質干細胞生長緩慢，這與龍燕鳴等[21]的研究結果基本一致。已有研究表明，全骨髓貼壁法具有良好的優越性，認為是骨髓間充質干細胞分離培養最常用的方法[12-15]，因此本文也采用全骨髓貼壁法分離培養骨髓間充質干細胞。本課題組前期通過不同濃度的ICA誘導后，發現0.8 g/100 mL淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞的增殖作用最強[17]，故本研究采用淫羊藿苷濃度為0.8 g/100 mL進行試驗誘導。Notch信號通路主要由Jagged 配體、Notch1受體及CBF1轉錄因子等組成，在細胞增殖、分化等過程中都發揮著重要的調控作用，尤其在骨髓間充質干細胞成骨分化中表現尤為突出[22]。已有研究顯示，Notch 信號經過受體與配體激活后引發一系列化學反應，表現在當進入細胞核后，再與Jagged1配體、CBF1結合，使骨髓間充質干細胞成骨分化受到抑制，主要在Notch信號通路Notch1受體進入細胞核后發揮作用[23-25]。Tian 等[26]通過淫羊藿苷動物試驗研究進一步表明，在藥物處理后CBF1蛋白表達量有明顯優勢，提示淫羊藿苷通過上調CBF1蛋白表達促進骨髓間充質干細胞成骨分化。細胞堿性磷酸酶（ALP）的活力和骨鈣素（OCN）活性是骨細胞分化的重要標志，也是骨髓間充質干細胞骨向分化的試驗指征[27]。本研究選取傳代的第三代（P3）骨髓間充質干細胞，以淫羊藿苷為靶標進行藥理作用研究，試驗組骨髓間充質干細胞在增長期呈S形生長，比對照組生長趨勢明顯，同時發現淫羊藿苷的處理明顯上調了骨髓間充質干細胞中ALP、OCN的水平，研究表明淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞的成骨分化有促進作用，這與李從文等[28]的研究結果基本一致。本研究利用West blot法檢測Notch信號通路相關蛋白質的影響，發現淫羊藿苷顯著降低了成骨誘導相關指標中Notch1、Jagged1和CBF1的表達，說明淫羊藿苷對細胞成骨分化的調節作用可能是由抑制Notch通路實現的，這與武坤等[29]的研究結果基本一致。本課題組也考慮成骨分化的過程可能涉及到信號通路等多種調控因素。在今后的骨分化研究中，將進一步驗證淫羊藿苷對Notch信號通路中其他蛋白或相關細胞因子成分的調控作用，探索淫羊藿苷對其骨分化過程中其他相關信號通路，例如NF-κB通路、RANK通路的影響。本研究可為淫羊藿苷應用于臨床骨質疏松癥的治療提供參考。

參考文獻：

[1]" 馬遠征，王以朋，劉強.中國老年骨質疏松診療指南（2018）[J].中國老年學雜志，2019，39（11）：2557-2575.

[2]" GENNARI L， BILEZIKIAN J P. New and developing pharmacotherapy for osteoporosis in men[J].Expert Opinion on Pharmacotherapy，2018，19：253-264.

[3]" WU Y Q， XIA L J， ZHOU Y N， et al. Evalua on of osteogenesis and angiogenesis of icariin loaded on micro/nano hybrid structured hydroxyapate granules as a local drug delivery system for femoral defect repair[J].Mater Chemistry B，2015;3（24）：4871-4883.

[4]" WANG Z， WANG D， YANG D， et al. The effect of icariin on bone metabolism and its potenal clinical application[J].Osteoporos Int，2018;29（3）：535-544.

[5]" 喬魯卉，馬子雨，郭浩宇，等.葛根素與淫羊藿苷對小鼠前成骨細胞生物學性能影響的比較[J].中國組織工程研究，2023，27（6）：872-877.

[6]" LI Y， YANG F， GAO M， et al. miR-149-3p regulates the switch between adipogenic and osteogenic differentiation of BMSCs by targeting FTO[J].Mol Ther Nucleic Acids，2019，17（3）：590-602.

[7]" 牛萍，趙月強，黃星原.骨髓間充質干細胞體外增殖及分化過程中Notch信號的表達變化[J].基礎醫學與臨床，2011，31（11）：1205-1209.

[8]" 劉剛，張磊，扶世杰.Notch信號通路在軟骨細胞分化過程中的作用[J].醫學研究生學報，2016，29（10）：1111-1115.

[9]" WANG C C， INZANA J A， MIRANDO A J， et al. NOTCH signaling in skeletal progenitors is critical for fracture repair[J].J Clin Invest，2016，126（4）：1471-1481.

[10] XU Y X， LI L Y， TANG Y T， et al. Icariin promotes osteogenic differentiation by suppressing Notch signaling[J].European Journal of Pharmacology，2019，865（11）：172794.

[11] 郭艷霞.淫羊藿苷對去卵巢大鼠骨質疏松癥的保護機制研究[J].四川中醫，2017，35（7）：63-65.

[12] 杜紅陽，付海燕，馬剛，等.地黃多糖在誘導大鼠骨髓間充質干細胞向神經樣細胞分化過程中對Notch1蛋白表達的影響[J].廣東醫學，2012，33（9）：1202-1206.

[13] 鄧洋洋.腎虛骨質疏松癥模型大鼠股骨、腎、下丘腦中BMP7-Smad1/5-Smurf1信號轉導蛋白的活性變化[D].沈陽：遼寧中醫藥大學，2008：9-11.

[14] 彭珊，歐陽厚淦，趙志冬，等.去卵巢大鼠骨質疏松模型的制備與評價[J].中國骨質疏松雜志，2017，23（10）：1327-1329，1358.

[15] 蒲曉姝，果磊，張敏珠，等.大鼠骨髓間充質干細胞的培養鑒定以及向神經干細胞分化的實驗研究[J].重慶醫科大學學報，2013，38（3）：235-239.

[16] 劉飛祥，譚峰，樊巧玲，等.CCK-8與MTT 法檢測左歸丸含藥血清干預BMSCs增殖條件的比較[J].中國骨質疏松雜志，2022，28（1）：6-10.

[17] 周亞妮，趙雪麗，趙永麗.淫羊藿苷對去卵巢大鼠骨髓間充質干細胞分化的影響[J].陜現代中西醫結合雜志，2023，32（15）：2060-2065，2070.

[18] 葛心慈，徐巖，吳瓊，等.左、右歸丸及其拆方對去卵巢大鼠骨髓間充質干細胞成脂分化的影響[J].中國骨質疏松雜志，2016，22（10）：1324-1328.

[19] 李小云，林青，王昊宇，等.骨髓間充質干細胞衰老與骨質疏松癥的研究進展[J].中國病理生理雜志，2023，39 （10）：1898-1903.

[20] WANG L J， ZHANG R P， LI J D. Transplantation of neurotrophin-3-expressing bone mesenchymal stem cells improves recovery in a rat model of spinal cord injury[J].Acta Neurochir （Wien），2014，156（7）：1409-1418.

[21] 龍燕鳴，謝夢生，黃加潔，等.酪蛋白激酶2相互作用蛋白1調控骨質疏松大鼠骨髓間充質干細胞的成骨能力[J].中國組織工程研究，2023，27（6）：878-882.

[22] JUSTICIA C， GABRIEL C， PLANAS A M. Activation of the JAK/STAT pathway following transient focal cerebral ischemia： signaling trough Jak1and Stat3 in astroeytes[J].Glia，2000，30（3）：253-270.

[23] 李瑞奇，白明，苗明三.中藥活性成分防治腦缺血特點分析[J].中醫學報，2013，28（8）：1184-1187.

[24] 吳春燕，程靜靜，劉顯斌，等.益氣養血補腎方對長期大強度運動大鼠海馬JAK/ STAT信號轉導通路的影響[J].山東體育學院學報，2015，31（3）：57-61.

[25] 韓文文，張玉蓮，張琳琳，等.益腎化濁方條件培養基對神經干細胞增殖分化影響的研究[J].時珍國醫國藥，2015，26（10）：2339-2342.

[26] TIAN H， BIEHS B， CHIU C， et al. Opposing activities of Notch and Wnt signaling regulate intestinal stem cells and gut homeostasis[J].Cell Reports，2015，11（1）：33-42.

[27] CAMP E， PRIBADI C， ANDERSON P J， et al. Inhibition of bone marrow Osteogenesis and can reduce abnormal bone formation of twist Haploidentical calvarial cells[J].Stem cells dev，2018，27（23）：1621-1633.

[28] 李從文，魏云林.植物雌激素的特性及其應用研究進展[J].基因組學與應用生物學，2020，39（3）：1264-1269.

[29] 武坤，郭翀，馬曉波，等.Notch1基因在T-ALL患者中的表達及其對NF-κB通路的影響[J].中國免疫學雜志，2022，38（8）：982-986.