黑龍江省稻瘟病病菌遺傳多樣性分析

摘要：利用11對SSR引物對黑龍江省20個(gè)縣（市、區(qū)）采集到的稻瘟病標(biāo)樣中分離得到的181個(gè)稻瘟病病菌菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，在72%的相似水平上可將供試菌株劃分為11個(gè)宗譜，其中Ⅱ宗譜為優(yōu)勢宗譜，其占總菌株數(shù)的54.71%。從同一地點(diǎn)不同植株上采集到的稻瘟病病菌菌株的親緣關(guān)系比較密切，但不同地區(qū)的稻瘟病病菌生理小種的分化程度不同，因?yàn)檫@與當(dāng)?shù)氐牡匦蔚貏萦幸欢P(guān)系，越是復(fù)雜的地形，該地區(qū)的稻瘟病病菌的分化也就相對越復(fù)雜。

關(guān)鍵詞：黑龍江省；稻瘟病菌；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S435.111.41 " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A " "文章編號(hào)：1674-1161（2024）01-0020-05

水稻（Oryza sativa）是世界上重要的糧食作物，也是世界上主要的糧食來源之一，其產(chǎn)量的高低直接影響著糧食安全。每年水稻被細(xì)菌、真菌和病毒侵染造成的減產(chǎn)高達(dá)30%～50%，其中稻瘟病對水稻生產(chǎn)的危害最大[1]，每年都會(huì)對水稻造成不同程度的損失[2]，已成為制約水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和影響品質(zhì)的主要因素，并嚴(yán)重威脅著世界糧食安全[3-4] 。作為我國主要產(chǎn)糧區(qū)的黑龍江省，每年由稻瘟病造成的產(chǎn)量損失占總產(chǎn)量的5%左右，而且其還會(huì)導(dǎo)致稻米品質(zhì)下降[5]。目前最經(jīng)濟(jì)有效的稻瘟病防治措施是選育抗性品種[6]，但由于稻瘟病病菌的生理小種組成復(fù)雜，致病性變異頻繁，在大面積推廣3～5 a后，抗性品種的抗病性會(huì)逐漸喪失[7]。因此，只有全面了解稻瘟病病菌的群體結(jié)構(gòu)特征，揭示其遺傳變異的本質(zhì)，才能真正解決品種抗性“喪失”的難題。

傳統(tǒng)的稻瘟病病菌生理分化研究都是依據(jù)鑒別品種的抗感差異來劃分，但這種劃分方法極易受到環(huán)境和人為因素的干擾，無法準(zhǔn)確全面地反映病菌的遺傳信息[8]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記來進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇（Maker?associated selection， MAS）可大大提高育種的效率和進(jìn)程[9]，這種方法可從分子層面來揭示稻瘟病病菌在各個(gè)地方的遺傳學(xué)差異[10]。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，建立以DNA指紋為基礎(chǔ)的多態(tài)性分子或功能標(biāo)記技術(shù)已對病原菌群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行過廣泛研究，如限制性片段長度多態(tài)性 （restriction fragment length polymorphism，RFLP）[11] 、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 （random amplified polymprohic DNA，RAPD）[12] 、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence?related amplified polymorphism，SRAP）[13]、Pot2-Rep-PCR[14] 、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）[15]和簡單序列重復(fù)（simple sequence repeat，SSR）[16] 等分子標(biāo)記均已被用于稻瘟病病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)的多樣性解析中，其中SSR標(biāo)記由于具有多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、重復(fù)性好、檢測方便等優(yōu)點(diǎn)，在研究稻瘟病病原群體的遺傳結(jié)構(gòu)時(shí)，已被廣泛采用。研究利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對黑龍江省20個(gè)縣（市、區(qū)）采集到的181個(gè)稻瘟病病菌菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，并結(jié)合環(huán)境地理位置，劃出區(qū)域來建立抗性監(jiān)測點(diǎn)，從而為合理布局黑龍江省各稻區(qū)的抗性品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的181個(gè)菌株采自黑龍江省20個(gè)縣（市、區(qū)），詳見表1。

1.2 稻瘟病病菌的單胞分離與保存

選取水稻穗頸瘟標(biāo)樣并用水充分沖洗，之后用酒精進(jìn)行表面消毒，再用無菌水沖洗3次以上即可放入裝有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中。將濾紙折一道紙痕以用于踮起標(biāo)樣，之后將濾紙用無菌水浸濕，再將沖洗過的穗頸瘟標(biāo)樣傾斜放入紙痕上。將培養(yǎng)皿放置于25 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后，用倒置顯微鏡鏡檢，當(dāng)看到有分生孢子產(chǎn)生時(shí)，在無菌空間下利用挑針轉(zhuǎn)移法[17]來獲得單孢，之后用濾紙片法保存。

1.3 稻瘟病病菌菌絲的收集

將濾紙片在培養(yǎng)基上進(jìn)行活化：25 ℃培養(yǎng)7 d后，挑取適量的病菌菌絲加入液體培養(yǎng)基中（葡萄糖10 g、酵母浸粉4 g、水1 L），之后放入震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，先濾除菌液，再將得到的菌絲用無菌紙吸干水分，最后進(jìn)行低溫儲(chǔ)藏以備用。

1.4 稻瘟病病菌基因組的DNA提取方法

將病菌菌絲在滅菌研缽中充分研磨成粉末，再用DNA提取試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)）來提取稻瘟病病菌菌絲的DNA，這一過程應(yīng)按照試劑盒說明書的步驟進(jìn)行。提取出的DNA用BIOSPEC-NANO來檢測DNA濃度，之后配平至150 "ng/μL以備用。

1.5 供試引物

11對引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，詳見表2。

1.6 PCR擴(kuò)增體系及電泳

PCR擴(kuò)增體系為：PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，體系中含有0.125 μL Taq酶、2.5μL 10×PCR Buffer、2 μL dNTP、1 μL模板DNA、1 μL正反引物、18.375 μL ddH2O。在PCR基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃下預(yù)變性2.5～5 min，94 ℃下變性30 s，55～57 ℃下復(fù)性1 min，72 ℃下延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃下延伸10 min，并于4 ℃下保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，先銀染檢測，然后用凝膠成像儀來照相記錄。

1.7 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)微衛(wèi)星引物擴(kuò)增的結(jié)果，將電泳照片轉(zhuǎn)換成2進(jìn)制的數(shù)據(jù)，并以Marker每個(gè)波段的分子量為標(biāo)準(zhǔn)來建立SSR的0-1數(shù)據(jù)庫，也就是有條帶記為“1”，不帶條記作“0”；應(yīng)用NTSYS 2.10軟件，并利用UPGMA方法來對反映菌株親緣關(guān)系的樹狀圖進(jìn)行聚類分析，之后計(jì)算DICE遺傳相似性系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑龍江省稻瘟病病菌菌株對SSR反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測結(jié)果

用11對SSR引物，對181個(gè)供試菌株的基因組DNA進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明：用引物MS677、D4、FG02、SMS17、MS355、MS363、A5、KMS02、KMS20、C3、G5分別對174、177、176、176、166、173、175、171、175、122、143個(gè)菌株擴(kuò)增出特異性帶。代表性擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。

2.2 黑龍江省稻瘟病病菌群體的遺傳結(jié)構(gòu)

對從黑龍江省各地采集到的181株穗頸瘟標(biāo)樣中分離出來的稻瘟病病菌菌株進(jìn)行了聚類分析，從分析結(jié)果來看，在52%的相似水平上，181株稻瘟病病菌菌株都在同宗譜內(nèi)；在60%的相似水平上，可以將其劃成3個(gè)宗譜，其中宗譜Ⅰ中含有132株菌株，占總菌株數(shù)的72.9%，宗譜Ⅱ中含有47株菌株，占總菌株數(shù)的26.0%，只有2個(gè)菌株處于宗譜Ⅲ；在72%的相似水平上可以劃成11個(gè)宗譜，其中宗譜Ⅱ?yàn)閮?yōu)勢宗譜，有99株菌株，占總菌株數(shù)的54.71%。宗譜Ⅰ、Ⅲ、Ⅶ分別包含13、16、40株菌株，占總菌株數(shù)的7.18%、8.84%、22.1%；宗譜Ⅴ、Ⅷ、Ⅸ、ⅰ分別包含2、3、3、2個(gè)菌株，占總菌株數(shù)的1.10%、1.66%、1.66%、1.10%；宗譜Ⅳ、Ⅵ、Ⅹ都只有1個(gè)菌株。相似水平下稻瘟病病菌菌株的遺傳宗譜見表3。

2.3 同一地點(diǎn)不同植株上稻瘟病病菌的遺傳結(jié)構(gòu)

從黑龍江省同一地點(diǎn)采集不同植株上的稻瘟病病菌菌株，在72%的相似水平上大部分歸于同一個(gè)宗譜，這表明同一地區(qū)的稻瘟病病菌菌株的親緣關(guān)系比較密切，如富裕縣2管區(qū)采集到的FY-1～FY-17全部屬于Ⅶ宗譜。但由于同一地區(qū)可能會(huì)存在多個(gè)稻瘟病病菌小種，且稻瘟病病菌極易出現(xiàn)小種分化，所以同一地區(qū)同一地點(diǎn)采集到的稻瘟病病菌菌株也有部分表現(xiàn)差異，如虎林市東方紅鎮(zhèn)采集到的5個(gè)菌株，有2個(gè)歸于Ⅷ、有3個(gè)歸于Ⅶ宗譜；密山市云山農(nóng)場采集到的10個(gè)菌株，有9個(gè)歸于Ⅶ、1個(gè)歸于Ⅷ宗譜。

2.4 不同地區(qū)稻瘟病菌的遺傳結(jié)構(gòu)

來自同一地區(qū)的稻瘟病病菌菌株大部分親緣關(guān)系比較近，但不同地區(qū)的稻瘟病病菌生理小種的分化程度不一，說明其分化程度與本地的地形山脈河流等自然環(huán)境有一定的聯(lián)系，例如北林區(qū)、慶安、望奎、鐵力等地處于松嫩平原東部、呼蘭河流域，其菌株多歸于Ⅱ、Ⅲ宗譜；虎林、密山等地處于完達(dá)山南麓，屬低山丘陵地帶，其菌株多歸于Ⅶ、Ⅷ宗譜；延壽地處松嫩平原與東部山地之間的丘陵地帶，其地處哈、牡、佳三市中間位置，堪稱“金三角”，其復(fù)雜的地理環(huán)境，所以在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ宗譜中都有其菌株存在。

3 結(jié)論與討論

從20世紀(jì)80年代末開始，在稻瘟病菌的群體分析中，廣泛使用了基于DNA多態(tài)性分析的分子標(biāo)記技術(shù)，其以菌株DNA帶的位置相似水平為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聚類，將菌株分成不同的親緣關(guān)系密切的族群，每一族群被稱為一種遺傳宗譜，以此來描述稻瘟病的族群[18-19]。這一研究結(jié)果表明，黑龍江省的稻瘟病無論在多大遺傳相似度的劃分上，都表現(xiàn)出了非常突出的優(yōu)勢宗譜，次要宗譜占一部分比例，而且還出現(xiàn)了一兩個(gè)菌株成為一個(gè)宗譜的特異性宗譜，構(gòu)成了極為復(fù)雜多變的遺傳多樣性特征，這表明黑龍江省的稻瘟病病菌具有極其豐富的遺傳信息，這可能與黑龍江省復(fù)雜的生態(tài)地理環(huán)境及水稻品種的多樣化有一定的關(guān)系。

試驗(yàn)利用11對SSR引物對黑龍江省20個(gè)縣（市、區(qū)）采集到的標(biāo)樣上分離到的單胞菌株進(jìn)行了遺傳多樣性分析，在72%的相似水平上，將181個(gè)供試菌株劃分為11個(gè)宗譜，其中Ⅱ宗譜為優(yōu)勢宗譜。在分析各地區(qū)水稻稻瘟病病菌的分布時(shí)發(fā)現(xiàn)，從同一地點(diǎn)不同植株上采集到的稻瘟病病菌菌株的親緣關(guān)系比較密切，但由于同一地區(qū)可能會(huì)存在多個(gè)稻瘟病病菌生理小種，且稻瘟病病菌極易出現(xiàn)小種分化，所以同一地區(qū)同一地點(diǎn)采集到的稻瘟病病菌菌株也有部分表現(xiàn)差異。來自同一地區(qū)的稻瘟病病菌菌株大部分親緣關(guān)系比較近，但不同地區(qū)的稻瘟病病菌生理小種的分化程度不一，其分化程度與當(dāng)?shù)氐牡匦蔚貏荨⑸矫}河流等自然環(huán)境有一定的關(guān)系，如按采集到的20個(gè)縣（市、區(qū)）的稻瘟病病菌菌株的遺傳關(guān)系及環(huán)境地理位置來建立抗性監(jiān)測點(diǎn)，可將其分為密山、虎林；富裕；五常；泰來；北林區(qū)、鐵力、慶安、望奎；阿城、尚志、香坊；延壽；依蘭；湯原；蘿北；富錦；方正、通河、木蘭共12個(gè)監(jiān)測點(diǎn)。稻瘟病病菌生理小種的分化程度與地形地勢有一定關(guān)系，地形越復(fù)雜，該地的稻瘟病病菌分化也就相對越復(fù)雜，這與前人的研究結(jié)果相似[20-22]。研究所用的稻瘟病病菌菌株直接采集于田間，采集時(shí)遵循多點(diǎn)、多面、多寄主品種的原則。如果能夠連年進(jìn)行檢測和鑒定，就可掌握黑龍江省各稻區(qū)稻瘟病病菌的群體結(jié)構(gòu)及變化規(guī)律，這不僅有助于預(yù)測其變化趨勢，還能夠合理調(diào)整指導(dǎo)稻瘟病抗性品種的種植結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高應(yīng)用品種防控稻瘟病的效果。

參考文獻(xiàn)

[1] 向聰，雷東陽，任西明，等.水稻抗稻瘟病遺傳育種研究進(jìn)展[J].作物研究，2017，31（5）： 547-552.

[2] 王艷青.近年來中國水稻病蟲害發(fā)生及趨勢分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22（2）：343-347.

[3] COUCH B C， KOHN L M. A multilocus gene genealogy concordant with host preference indicates segregation of a new species， Magnaporthe oryzae， from M. grisea [J]. Mycologia，2002， 94（4）：683-693.

[4] WILSON R A， TALBOT N J. Under pressure： investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae [J]. Nature reviews microbiology，2009（7）：185-195.

[5] 馬成云，申宏波，馬淑梅，等.黑龍江省水稻稻瘟病發(fā)生危害情況調(diào)查及防治建議[J].植物保護(hù)，2006，32（5）：95-97.

[6] HAMER J E. Molecular probes for rice blast disease[J].Science，1991（252）： 632-633.

[7] 周江鴻，王久林，蔣琬如，等.我國稻瘟病菌毒力基因的組成及其地理分布[J].作物學(xué)報(bào)，2003，29（5）：646-651.

[8] 劉學(xué)敏，楊建華，呂軍，等.RAPD技術(shù)在檢測植物病原真菌遺傳多樣性中的應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1997， 28（1）： 99-102.

[9] 沈新蓮，張?zhí)煺?作物分子標(biāo)記輔助選擇育種研究的進(jìn)展與展望[J].高技術(shù)通訊， 2003（2）： 105-110.

[10] 謝藝賢，鄭服叢.應(yīng)用DNA分子進(jìn)行真菌分類的原理及方法[J].華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000， 6（1）：35-40.

[11] 王宗華，魯國東，趙志穎，等.福建稻瘟病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)及其變異規(guī)律[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1998，31（5）：7-12.

[12] 鄧曉玲，安淑文，劉思國，等.稻瘟病菌群體的分子遺傳學(xué)研究I.廣東省1998—1999年稻瘟病菌的遺傳多樣性[J].菌物系統(tǒng)，2002，21 （1）：53-62.

[13] 吳偉懷，王玲，程貫忠，等.稻瘟病菌群體的分子遺傳學(xué)研究—廣東省與云南省稻瘟病菌群體遺傳及致病型結(jié)構(gòu)的比較分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（5）：675-680.

[14] 張重權(quán)，何霞紅，王云月，等.云南粳稻區(qū)水稻品種多樣性田間稻瘟病菌群體的遺傳結(jié)構(gòu)[J].中國水稻科學(xué)，2004，18（4）：346-350.

[15] TAHERI P， IRANNEJAD A. Genetic structure of various Magnaporthe oryzae populations in Iran and Uruguay [J]. Aus plant pathol，2014，43（3）：287-297.

[16] 蘭波，孫強(qiáng)，楊迎清，等.基于SSR序列的江西省不同生態(tài)地區(qū)稻瘟病菌遺傳多樣性分析[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2020，47（2）：292-301.

[17] 龔國淑，徐琴，張敏等.一種簡便的病原真菌單孢分離方法研究[J].玉米科學(xué)，2010，18（1）：126-127+134.

[18] HAMER J E L， FARRALL L， ORBACH M J， et al. Host species-specific conservation of a family of repeated DNA sequences in the genome of a fungal plant pathogen [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1989（86）：9981-9985.

[19] CHEN D H， ZEIGELER R S， LEUNG H， et al. Population structure of Pyicularia grisea at two screening screening sites in the Philippines [J].Phytopathology，1995，85（9）：1011-1020.

[20] 劉二明，劉志賢，魏林，等.湖南兩類稻瘟病生態(tài)系病菌群體遺傳多樣性研究[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，29（3） ：211-215.

[21] 白珍安，任佐華，毛瑩，等.桃江和瀏陽病圃稻瘟病菌遺傳多樣性的 SSR 分析[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（7）： 7-10.

[22] 任林柱，王慶鈺，白容霖.吉林省部分水稻品種稻瘟病菌 Pot2指紋分析[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27（4）：369-372.

Genetic Diversity Analysis of Strains of P. oryzae in Heilongjiang Province

ZHOU Yan1，ZHANG Yaling2，MU Yonghong1，NA Yongguang1，JIN XueHui2*

（1.Rice Research Institute，Heilongjiang Academy of Land Reclamation Science， Jiamusi Heilongjiang 154000， China; 2.College of Agriculture， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing Heilongjiang 163319， China）

Abstract： The genetic diversity of 181 strains of P. oryzae isolated from 20 P. oryzae blast samples in Heilongjiang Province was analyzed by 11 pairs of SSR primers. The results showed that the tested strains could be divided into 11 genealogies at the similarity level of 72%， and the Ⅱ genealogies were the dominant genealogies， which accounted for 54.71% of the total strains. The strains of P. oryzae collected from different plants in the same location were closely related， but the degree of differentiation of P. oryzae physiological small species in different regions was different， because it was related to the local topography. The more complicated the topography， the more complicated the differentiation of P. oryzae in the region was.

Key words：Heilongjiang Province; strains of P. oryzae; genetic diversity