同工酶技術及其在水產動物中的應用

摘要：同工酶作為一種重要的生物標志物，在諸多領域都有著重要作用。本文綜述了同工酶的研究方法以及應用于水產動物上的研究，包括水產動物的種群遺傳、親緣關系分析、生物種質、病理診斷等研究方面，并且重點論述了同工酶在水產動物種質特性和在育種方面的應用，同時提出了同工酶技術的進一步應用前景。

關鍵詞：同工酶；水產動物；應用研究

中圖分類號：S917.4 文獻標識碼：A

作者簡介：曹文韜（2001—），男，碩士，研究方向：水產經濟動物育種技術。E-mail：1373157785@qq.com

*通訊作者：王曉清（1964—），男，教授，研究方向：水產經濟動物育種技術。E-mail：wangxiao8258@126.com

同工酶（isozyme）是指在不同的生物體或同一生物體的不同組織中，由于基因突變或基因表達調控導致產生具有相同催化活性但氨基酸序列不同的酶^［1］，由不同的基因位點或同一位點的等位基因編碼形成^［2］，最早由Markart和Moller于1959年提出^［3］。研究最早且最多的為乳酸脫氫酶（LDH），其他常見同工酶，如酸性和堿性磷酸酶（ACP和AKP/ALP）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷草轉氨酶（GOT/AST）、核苷磷酸化酶（NP）、蘋果酸脫氫酶（MDH）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）以及膽堿酯酶（ChE）等，都在細胞物質轉換與能量代謝中扮演了無可替代的角色。這些蛋白質在生物體中的作用包括但不限于調節代謝途徑、適應環境變化及組織特異性表達^［4］。同工酶的識別、檢測與分類，已從初期的電泳法逐步過渡到利用精密的質譜和多維色譜技術^［5］，并且目前可通過高通量組織芯片結合免疫組織化學技術（IHC）對同工酶進行檢測^［6］。而對于這些蛋白分子結構與功能關系的理解，也由淺入深逐步透徹。同工酶以其獨特的分子特性，在諸多領域都有著重要作用。本文對近年來同工酶的研究現狀做了總結，為加強在水產動物相關研究中的應用提供理論參考。

1 同工酶的研究方法

1.1電泳技術

同工酶的研究最早是通過電泳法來進行分析，是鑒定和分離不同同工酶形式最常見的方法。通過凝膠電泳，利用酶特異性染料或基質，可以直觀地區分和觀察不同的同工酶圖譜。這種方法的優勢在于其相對簡單直觀，并且能夠處理大量樣本。同工酶分析最早是通過淀粉凝膠電泳來分析其酶帶，之后為了提高同工酶電泳的分辨率和重現性，逐漸發展成聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、電聚焦電泳（IEF）和二維電泳等方法。楊光瑞等^［7］綜述了同工酶檢測的4種凝膠電泳方法，包括瓊脂糖凝膠電泳、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）、變性-復性聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）以及雙向凝膠電泳，并指出瓊脂糖凝膠電泳相比于PAGE檢測成本低、耗時少以及制膠簡單，但其分辨率和分離效果均不如PAGE檢測，還指出其他單向凝膠電泳的分辨率和分離效果均不如雙向凝膠電泳，但是雙向凝膠電泳缺點在于分離同工酶較容易使酶失去活性，對于堿性同工酶的分析影響更大。Hassan等^［8］通過同工酶電泳和脂肪酸含量的變化，成功發現了草魚性腺發育過程中腦垂體內分泌細胞的變化與卵泡發育的變化是平行的。黃培衛等^［9］利用PAGE檢測了斜帶石斑魚、赤點石斑魚以及青紅雜交斑（斜帶石斑魚為母本，赤點石斑魚為父本）的LDH在7種組織中的分布和活性表達情況，發現斜帶石斑魚的這些組織中均有LDH酶譜帶出現，而赤點石斑魚和青紅雜交斑只有肝臟中沒有LDH圖譜，且青紅雜交斑的LDH酶帶顏色相比兩種親本相對更淺，表明雜交斑比其親本有更好的均衡性，為鑒定不同石斑魚提供了參考。

1.2 免疫學技術

免疫學技術是同工酶常用分析方法之一，利用特異性抗體可以檢測和定量特定同工酶。通過西方印跡法和酶聯免疫吸附測定（ELISA）等方法，可以獲得關于同工酶蛋白水平及其在不同組織中的分布信息。例如LDH同工酶的檢測和定量可基于免疫學技術的測定法進行^［10］。而蛋白質印跡、免疫染色和ELISA等標準技術可以定量分析正常和病變組織中的CA同工酶，通常與凝膠電泳等蛋白質分離技術同時使用^［11］。

1.3 生物學技術

現代分子生物學技術為同工酶的研究提供了更精確的方法。聚合酶鏈式反應（PCR）和DNA測序技術等可以用于分析編碼同工酶的基因序列，從而發現能影響酶活性和結構的遺傳變異。同時可通過實時定量PCR（RT PCR）、轉錄組學和蛋白質組學等技術，在基因和蛋白質水平上研究同工酶的表達差異。唐小紅^［12］通過RT PCR技術檢測了草魚三種不同類型PK（丙酮酸激酶）基因在不同組織和早期發育不同時期的相對表達量，成功獲得了這些酶基因組織表達特征和早期發育規律，確認了其中兩種酶為草魚肝臟型和肌肉型丙酮酸激酶同工酶（PKL和PKMb），并且首次在魚類中發現了PK-like型同工酶，但是研究發現草魚的PK-like與斑馬魚的肌肉a型PK具有較高的同源性（達95%），卻主要在心臟中表達，這與大鼠的PKM1型表達情況相似。但該研究中發現這種PK-like型同工酶關鍵活性位點不保守，因此這種PK-like同工酶類型仍需進一步驗證。

1.4 其他技術

質譜技術是近年來發展迅速的一種高精度同工酶分析技術。通過精確測量蛋白質和肽段的質量能夠識別出同工酶特定翻譯后修飾，并且具有量化能力^［13］。這一技術在確定同工酶的結構及其種類、分析其在生物體中的動態變化以及對同工酶活性影響上日益重要。李佩佩^［14］先通過pull down技術（一種蛋白質相互作用實驗），進行了12%SDS-PAGE電泳分析來檢測蛋白質間的相互作用情況，成功獲得了一條分子量大約為42 kDa的譜帶，將該酶譜條帶經過考馬斯亮藍染色基質染色后，然后將其割下，最后用于質譜分析，發現該譜帶是文昌魚的CK酶譜帶。

2 同工酶在水產動物研究中的應用

2.1 用于水產動物種群遺傳與親緣關系分析

在水產動物的研究領域中，通常種群遺傳結構和親緣關系分析可以為物種保護、育種方案規劃以及生態系統健康評估提供基礎數據。同工酶作為一類由基因等位變異所導致的結構或電荷差異的酶分子，成為了種群遺傳多樣性研究的重要工具。由于不同物種同工酶的結構存在差異，進行電泳時能夠分離出不同的酶譜帶，通過對比同工酶圖譜，可以反映出氨基酸的組成，根據這一特性進而探討種群或亞種間的親緣關系^［15］。丁立云等^［16］指出了同工酶技術在揭示水產動物種群遺傳結構中的重要應用，探討了同工酶技術在鑒定物種和亞種親緣關系方面的應用，通過分離同工酶并分析其電泳帶型的差異，能夠直觀反映個體間的遺傳差異，對評估同一物種不同地理群體間的遺傳異質性提供了技術支撐，以及對種群內部的遺傳分化情況能有更深的理解。進一步的分析還可揭示種群歷史動態，如瓶頸效應和擴張事件，這對于制定合理的漁業管理措施至關重要。包永波等^［17］強調將分子標記和同工酶分析結合在動物中能夠提供更全面的信息，通過這些方法結合可以反映出不同貝類種群的遺傳差異和雜交種的遺傳構成，不僅有利于保護和合理利用貝類資源，也為貝類育種提供了科學依據。與此同時，同工酶技術的應用為檢測貝類種群之間雜交的情況提供了一種直接而有效的方法。

在應用實踐中，對同工酶圖譜的定量分析常常涉及計算等位基因頻率（Pi）、遺傳多樣性指標（He）以及同工酶的多態性度（P）等指標。張林等^［18］通過對羅氏沼蝦進行同工酶和遺傳多樣性分析，對其肌肉和鰓的4種同工酶（LDH、EST、MDH以及ADH）共檢測出22個等位基因和15個基因位點，這些位點的平均有效等位基因數（Ne）為1.47。這些酶共有7個Pi為0.15～0.85的多態位點，而多態位點的比例（P）為46.7%，表明該物種群體中同時存在雜合子過剩和缺失的現象，且雜合子過剩現象更為明顯。這說明該群體遺傳變異的范圍和程度均較大，具有較高的群體遺傳多樣性，因此可作為良好的親本用于人工育種工作。

2.2 用于魚類發育與組織特異性研究

同工酶作為一種能夠反映遺傳多樣性和生物適應變化的生物標志物，在魚類的發育與組織特異性研究中發揮著不可忽視的作用。通過對特定同工酶活性或基因型的分析，能夠追蹤各發育階段的代謝變化和生長速率。而利用酶活性分析研究可以明確區分不同的發育階段，比如受精卵、胚胎、幼體等，這對研究發育過程的遺傳調控機制至關重要^［17］。李政等^［19］指出不同組織中的同工酶表達差異可以揭示這些組織在新陳代謝、生理功能及對環境因素反應上的獨特性。

特定同工酶的組織分布研究不僅加深了對魚類生理生態的認識，也為魚類資源的進一步利用和保護提供了科學依據。AL-Harbi等^［20］通過對尼羅羅非魚不同組織的MDH同工酶進行組織特異性研究，發現MDH-1和MDH-2只在肌肉和心臟中表達，而MDH-3在研究的所有組織中都有表達，MDH的百分比量一般在肌肉和其他不同組織之間有著顯著變化。張濤等^［21］對新疆裸重唇魚的不同組織中的LDH、MDH以及EST（酯酶）進行了電泳分析，研究發現該魚的LDH、MDH以及EST同工酶在個體間存在差異且有組織特異性，可從生化遺傳角度為保護新疆裸重唇魚的種質資源和進一步利用提供理論支持。

2.3 用于種質鑒定及種質特性研究

魚類作為水產養殖與水生生態研究的重要對象，其形態分類和群體遺傳分析是了解其多樣性、親緣關系以及應對環境變化的關鍵。在魚類的形態分類與群體遺傳研究中，同工酶分析技術具有不可替代的作用，特別是在種質鑒定、評估種群遺傳多樣性以及追蹤種群遺傳結構變化等方面顯示了獨特的優勢^［22］。

2.3.1 種質鑒定

種質鑒定是通過對種質資源進行檢測和分析，確定其遺傳特征和品質特點的過程。種質鑒定可以包括外部形態、生理生化特征及遺傳分析等方面的評估和測試。利用同工酶分析技術可為魚類種質鑒定提供技術支持，張芹等^［23］對兩種不同地理種群的團頭魴進行了同工酶的生化遺傳分析，發現兩者肌肉組織中的LDH同工酶圖譜及酶條帶數均存在顯著差異，因此可作為生化水平上鑒別伊河團頭魴和梁子湖團頭魴的遺傳鑒別標記，且伊河團頭魴不同個體眼睛的LDH同工酶圖譜特征一致、穩定且分離效果良好，可作為鑒定伊河團頭魴種質的生化遺傳標記。梁家僖等^［24］檢測與分析了翹嘴鱖、斑鱖以及這兩種鱖魚雜交的F1代在不同組織中的LDH、MDH以及EST同工酶，研究結果顯示，這些同工酶酶譜特征在各個物種之間存在明顯的差異，其中肝臟和腎臟中的LDH和EST同工酶酶譜以及肌肉中的EST同工酶酶譜展現出顯著且穩定的物種特異性差異表達，這些特征可作為區分這三種鱖魚遺傳特性的關鍵生化遺傳標志。

2.3.2 基因座位多態性

基因座位多態性是指在基因組中某個特定基因座位上存在兩種或兩種以上的不同等位基因。這個基因座位上的多態性可以是由于單個核苷酸的改變，也可以是較大的插入、缺失或替換變異。基因座位多態性是遺傳多樣性的基礎，是自然選擇和進化的原材料之一。比如上清液型蘋果酸脫氫酶（s-MDH）通常由2個獨立的基因（A、B）編碼，常在魚類的各個組織器官中表現為3條偏向陽極的酶帶，但是四倍體的鮭鱒魚類，由于基因重復且可能發生了突變，會出現由3～4個基因編碼的情況^［21］。LDH在魚類中一般由5個等位基因編碼，而江鱈中的這5個基因位點均為多態^［25］。鄭保霄等^［26］對象山港藍點馬鮫9種組織中的8種同工酶酶譜分析，結果表明MDH、EST和MEP（蘋果酸酶）三種同工酶在組織中表達具有多態性。

2.3.3進化分析

同工酶分析技術是一種常用的生化分析方法，通過研究酶活性的差異和表達情況可用于推斷物種或個體間的遺傳關系和進化歷史。同工酶電泳技術為自然種群遺傳變異、基因流動估計、種間限制的闡明以及對不同分類群之間的進化關系建立提供了重要信息，任何同工酶酶位點顯著變異都代表了同源種群基因的流動障礙，并可能導致至少部分群體會存在生殖隔離的情況，在具有有性生殖的生物體中，這種變異表明兩個種群應被視為不同物種^［27］。Limeira等^［27］對來自兩個不同地理區域的銼甲鯰屬不同組織中的12個同工酶系統的22個位點進行了分析，表明由于它們在形態學以及多態性位點的等位基因頻率上有所不同，因此這兩種魚在遺傳分化過程中成為了兩個不同的物種。

在探討同工酶與進化關系時，通常利用同工酶生化遺傳特征揭示物種間的遺傳差異和進化親緣關系。馬波等^［28］對綏芬河三塊魚和珠星三塊魚同工酶的生化遺傳分析比較，發現兩者具有相同的基因位點和等位基因而表現出有很近的親緣關系，說明應是由共同祖先分化而來。

2.4 在病理診斷與治療中的應用

從分子生物學的角度分析，同工酶在細胞和分子層面起著至關重要的作用。同工酶在疾病的診斷與治療中具有獨特的地位，通過反映細胞內的代謝狀態為病理研究提供了新的視角。在疾病診斷方面，同工酶的分析研究能夠為水產動物病理機制的解析提供重要線索，并且同工酶還可以作為生物標志物被檢測以識別特定的病理條件，促進疾病預防及治療策略的制定。李奇等^［29］分離純化的沙蠶蛋白酶同工酶組，為研究它們在疾病過程中的變化提供了工具。

同工酶技術對于水產動物疾病預防和控制同樣具有重要作用。王宏偉^［30］強調了酶譜分析在水產養殖病害監測和預防中的重要性，當酶系統發生較大變化往往預示著生物體的健康將會受到風險，通過定期監測同工酶活性不僅可以早期發現病理狀態，還有助于評估疾病治療效果。李政等^［19］對同工酶技術在水產動物生理及疾病研究中的應用進行了系統總結，表明該技術在揭示水產動物生理響應機制和疾病發生機理方面具有很大的價值和潛力。

同工酶是同一酶系中在分子層次上略有不同的酶，這些差異常常與特定生物功能或病理狀態有關，當一些水產動物受到外界惡性環境壓迫，其某一組織、器官或者細胞出現病變甚至死亡，同工酶活性及表達情況也會發生改變^［31］。因此將同工酶的評估與常規標志物相結合，可能有助于早期風險評估、密切監測和及時管理疾病^［32］。在研究病理生理學過程中，同工酶電泳資料的評估通過可視化不同同工酶的電泳模式，以此監測特定病理狀況下同工酶的表達變化^［33］。隨著同工酶研究方法的發展，不僅提高了靈敏度和特異性，還有利于在更早期檢測出病理狀態的同工酶變化情況，對早期診斷有巨大幫助^{［32，34］}。

2.5 同工酶在水產動物育種中的應用

2.5.1 雜交育種

雜交育種是一種利用基因重組技術來培育新品種的育種方法。同工酶在雜交育種中可以作為一種生物學標記來評估雜交后代的遺傳特性，幫助育種者評估雜交效果、監測基因表達、分析遺傳多樣性、輔助選擇育種以及進行分子標記輔助選擇，可以提高育種的效率和成活率。孫俊霄等^［35］通過檢測雜交黃顙魚和普通黃顙魚在低氧脅迫下血清和肝臟中的SOD、CAT及LDH三種同工酶活性的變化，發現前者這三種酶活性變化幅度大于后者，說明雜交黃顙魚的抗氧化能力更高。

2.5.2 選擇育種

選擇育種是水產動物常用的育種方法，通過選擇具有優良性狀的個體進行繁殖，從而逐漸培育出所需的品種，以提高水產品的產量和質量。通過對同工酶分析可以檢測不同個體之間的遺傳差異和多態性，比較特定酶在不同個體中的酶活性差異，可以選擇具有優良遺傳特性的個體用于進一步繁殖。王寧等^［36］在選育中間養成階段的凡納濱對蝦的軟顆粒飼料中添加新鮮餌料（鰱魚、魷魚）和海洋性動物水解蛋白（酶解魚漿、酶解蝦漿）來替代傳統飼料（魚粉蛋白），通過檢測5組凡納濱對蝦血清中的ALP、ACP、AST、SOD、ALT（谷丙轉氨酶）和LZM（溶菌酶）的活性，發現投喂飼料中添加了新鮮餌料和海洋性動物水解蛋白的凡納濱對蝦血清中的AST、ALT、ACP、ALP、SOD和LZM活性顯著高于投喂飼料為魚粉蛋白的凡納濱對蝦，表明選育的凡納濱對蝦生長性能、體組成和免疫均有提升。

2.5.3 雌核發育

雌核發育作為水產動物育種的方法之一，這種方法的精子的核DNA并不參與其中，只具有母體的遺傳特征，同工酶作為一種遺傳標記，可用來分析和比較不同卵母體或種群中的遺傳差異和特征。同工酶技術的應用可以提供雌核發育過程的遺傳信息，從遺傳層面上了解雌核發育中母體的遺傳過程和機制，有助于了解和優化雌核發育的育種策略，以提高育種效果和養殖產能。陳寶增^［37］分析了人工誘導斑馬魚雌核發育子代、雌性親本及雄性親本不同組織中的四種同工酶（EST、LDH、SOD及MDH），發現雌核發育子代的同工酶基因表達與母本較為一致，但在不同組織中與父本相比存在較大差異。這表明雌核發育所產生的后代是一個高度純合的群體，人工誘導斑馬魚雌核發育這種育種策略較為可行，但在不同條件下是否還能生存還有待研究。

3 展望

隨著生物技術的快速發展和分子生物學的進一步深入，同工酶研究正成為生命科學領域的一個熱點，同工酶的研究前景廣闊，無論是在科學理論的探索還是實際應用的拓展中，都顯示出極大的潛能。本文在總結同工酶的研究方法和在水產動物上的研究應用的基礎上，針對同工酶未來的研究方向和應用領域，提出以下六點應用前景展望。

（1）隨著基因組學和蛋白質組學的發展，未來同工酶的研究將更加注重整體性和系統性。逐漸明晰的是，同工酶不僅僅是獨立的酶分子，它們在生物體內是通過復雜網絡相互作用，完成生物體的生理功能。因此通過系統生物學方法研究同工酶之間的相互關系及其對整個代謝網絡的影響，會成為一個趨勢。基因編輯技術如CRISPR-Cas9的運用，有望進一步通過敲除或敲改特定同工酶基因，深入理解其功能和調控機制。

（2）同工酶的研究將進一步推進個體化醫療的發展。在診斷和治療的層面，個體中同工酶表達差異與疾病的相關性是未來研究的重點。通過對患者特定同工酶的分析，不僅可以實現疾病的早期診斷和病情的監測，同時還有望根據患者同工酶的活性和遺傳差異來定做個性化的治療方案，從而在精準醫療領域發揮重要作用。

（3）同工酶在水產動物更深入的研究將進一步提升水產品的遺傳改良和育種工作。利用更多種同工酶標記，可以有效輔助研究人員識別某些重要性狀相關基因，為分子輔助選擇提供準確的遺傳背景信息。同工酶研究在水產動物生理、抗逆性、病害抵抗力等方面更深入的進展，將直接促進水產品的改良和增產。

（4）同工酶做為生物指示劑的應用潛力亦不容忽視。環境污染和生態平衡的問題日益嚴重，同工酶在生態監測與評估中的作用越來越重要。研究不同環境條件下，生物體內同工酶構成的變化可以為環境污染的早期預警提供新方法。特別是各種有毒重金屬和有機污染物對生物體同工酶活性的影響研究，能夠為生態風險評估提供科學的量化指標。

（5）同工酶檢測技術本身的發展也十分重要。目前常用的電泳、免疫學檢測等方法雖然成熟，但在靈敏度、特異性以及高通量分析方面仍然存在局限。新興的質譜技術、芯片技術和計算生物學的應用預計將使同工酶的鑒定和量化分析更加快速、準確。高通量的同工酶分析將推動大數據時代下生物信息學的發展，助力深入挖掘同工酶在生物體中的復雜功能及其調控模式。

（6）同工酶技術的局限性。同工酶電泳作為群體遺傳學的一個重要研究手段，可以有效地檢測不同地理居群或養殖種群種內、種間生化遺傳差異及群體遺傳結構^［38］，然而同工酶分析在實際應用中也存在局限性，不同物種的同一同工酶可以表現出相似的電泳帶型，因此物種辨識上會存在困難。另外環境因素和發育階段的變化也可能影響同工酶表達，為分析結果帶來干擾，因此建立一套標準的同工酶電泳操作流程和解析數據的統一規范顯得至關重要。

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