不同濃度新鮮蛋清對大鼠足跖腫脹急性炎癥模型的研究

摘要：目的" 通過對不同濃度新鮮蛋清所致的大鼠足跖腫脹研究，優選出新鮮蛋清所致的大鼠足跖腫脹急性炎癥模型條件。方法" 選用蛋清原液、50%蛋清和10%蛋清3個濃度，于大鼠后足足跖部位皮下注射，分別檢測致炎前和致炎后0.5、1、2、3和4 h大鼠的足跖腫脹度，優選出蛋清所致的大鼠足跖腫脹急性炎癥模型最佳造模濃度和作用時間，并采用陽性藥阿司匹林對優選建立的大鼠足跖腫脹模型條件進行驗證。結果" 與10%蛋清相比，50%蛋清和蛋清原液在致炎后1、2和4 h，大鼠的足跖腫脹度升高（Plt;0.05）;足跖腫脹度在1 h達到高峰，蛋清原液、50%蛋清、10%蛋清分別為（0.80±0.08、0.78±0.09、0.40±0.13）ml，而后逐漸下降，但二者致炎效果無明顯差別（Pgt;0.05）。以50%蛋清濃度作用1 h為造模條件，結果顯示阿司匹林組的腫脹度和TNF-α含量低于50%蛋清組（Plt;0.05）。結論" 50%蛋液濃度作用1 h為最佳的大鼠足跖腫脹急性炎癥模型條件。

關鍵詞：蛋清;足跖腫脹;急性炎癥

中圖分類號：R285.5" " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2023.08.013

文章編號：1006-1959（2023）08-0064-04

Study of Different Concentrations of Fresh Egg Albumen on Acute Inflammation Model

of Rat Paw Swelling

SUN Xiao-jing，HUANG Jin-lan

（School of Basic Medicine，Xuzhou Medical University，Xuzhou 221004，Jiangsu，China）

Abstract：Objective" To investigate the optimal conditions of rat paw oedema model induced by implying egg albumen on foot swelling of rats with different concentrations.Methods" Three concentrations of egg albumen （egg albumen stock solution， 50% egg albumen and 10% egg albumen） were selected and subcutaneously injected into the hind paw of rats. The paw swelling degree of rats before inflammation and 0.5， 1， 2， 3 and 4 h after inflammation was detected respectively， and the optimal concentration and action time of acute inflammation model of rat paw swelling induced by egg white were selected. Aspirin was used to verify the optimal conditions of the rat paw oedema model.Results" Compared with the 10% egg albumen， the degree of foot swelling of the rats was significantly increased at 1， 2 and 4 h after 50% and 100% egg albumen were used （Plt;0.05）. The degree of plantar swelling reached its peak at 1 h， the egg albumen stock solution， 50% egg albumen and 10% egg albumen were （0.80±0.08） ml， （0.78±0.09）ml and （0.40±0.13） ml， respectively， and then gradually decreased， but there was no significant difference in the inflammatory effect between the two groups（Pgt;0.05）. 50% egg albumen concentration for 1 h as the modeling condition， the results showed that the swelling degree and TNF-α content in aspirin group were lower than those in 50% egg white albumen （Plt;0.05）.Conclusion" The optimum condition for the rat model of foot swelling is 50% egg solution for 1 h.

Key words：Egg albumen;Pedal swelling;Acute inflammation

炎癥（inflammation）是機體對各種有害刺激，如感染、外傷等損傷因子刺激的一種防御性反應[1-4]。研究顯示[5-8]，炎癥與多種疾病如關節炎、哮喘、動脈粥樣硬化、糖尿病、帕金森、癌癥等緊密相關。如若處理不當，急性炎癥可轉向慢性炎癥，會影響患者疾病的預后和生活質量。因此，篩選安全有效的抗炎藥物具有重要的臨床價值。在抗炎藥物篩選過程中，操作簡單、高效、可靠和重現性好的動物模型可大大縮短藥物研發周期、降低研發成本，對藥物的篩選研究作用發揮重要的作用[9-11]。足跖腫脹模型是經典的評價或篩選抗炎藥模型之一[12]，模型致炎物質常選用角叉菜膠、右旋糖酐、弗氏完全佐劑、蛇蝎毒液、瓊脂和蛋清，以角叉菜膠所致的足跖腫脹模型研究頗多。蛋清誘導所致足跖腫脹模型研究較少，不同濃度新鮮蛋清對動物足跖腫脹的報道罕見。本研究擬通過實驗探索蛋清濃度炎癥依賴關系，旨在為以蛋清誘導所致足跖腫脹模型優化提供更多的實驗依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器" 新鮮蛋清;阿司匹林（大連美侖生物技術有限公司，MB1790）;PV-200足趾容積測量儀（成都泰盟軟件有限公司）;小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫試劑盒（酶免公司）;BCA蛋白濃度檢測試劑盒（增強型）（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.1.2實驗動物" SPF級SD大鼠54只，雌雄各半，體重（250±30）g，由徐州醫科大學實驗動物中心提供[實驗動物使用許可證號SYXK（蘇）2020-0048]，飼養環境溫度：22 ℃～24 ℃、濕度：50%～65%，自由飲水、攝食。動物操作嚴格按動物倫理標準開展。

1.2方法

1.2.1不同濃度蛋清致足跖腫脹的作用" 選取體重合格的SD大鼠30只，雌雄各半，設立蛋清原液組，50%蛋清組（使用生理鹽水按1∶1體積比稀釋蛋清原液即得）和10%蛋清組（使用生理鹽水按1∶9體積比稀釋蛋清原液即得），10只/組。致炎前先在每只大鼠后足踝關節同個位置做標記測量線，左手固定大鼠頸背部皮膚，右手捉住大鼠后膝關節處使其后腳伸直，浸入測量杯。當水平面與大鼠足上的標記線重疊時，記錄顯示屏讀數即為每只大鼠后足足跖基礎容積。而后在每只大鼠同一后足足跖部位皮下給予相應濃度的蛋清（100 μl/只），在致炎后的0.5、1、2、3、4 h分別測定足跖容積。按照以下公式計算后足足跖腫脹度。腫脹度（ml）=致炎后足跖容積（ml）-致炎前足跖基礎容積（ml）。

1.2.2足跖腫脹模型驗證" 另取SD大鼠24只，按體重隨機分為對照組、模型組和阿司匹林組（10 mg/kg），8只/組。先對每只大鼠進行后足足跖基礎容積的測量，而后阿司匹林組給以阿司匹林灌胃1次，對照組和模型組給予相應體積的生理鹽水，給藥后1 h，模型組和阿司匹林組大鼠后足足跖部位皮下給予50%蛋清（100 μl/只），對照組大鼠后足足跖部位皮下給予100 μl生理鹽水，致炎后1 h檢測大鼠足跖腫脹度。檢測完畢后頸椎脫臼處理大鼠，自踝關節剪下右后足跖，剖皮、剔骨，剪碎組織，加入適量PBS（pH7.4），電動勻漿器制備組織勻漿液，5000 r/min離心15 min。仔細收集上清，上清分為兩部分，一份采用BCA法檢測樣本的蛋白濃度，根據樣品數量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50∶1）配制適量BCA工作液。將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20 μl加到96孔板的標準品孔中（加標準品稀釋液補足到20 μl），加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中（如樣品不足20 μl則補足20 μl），各孔加入200 μl BCA工作液，37 ℃放置30 min。用酶標儀測定波長為562 nm的吸光度值，并根據標準曲線和使用的樣品體積計算出樣品的蛋白濃度。另一份采用雙抗體夾心法測定標本中小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。所有操作嚴格按照說明進行，根據樣本數量使用酶標包被板，設置標準品孔、樣本孔和空白孔。標準品孔各加不同濃度的標準品 50 μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測樣品10 μl（樣品最終稀釋度為5倍），空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同。加樣時將液體加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，并輕輕晃動混勻。先每孔加入酶標試劑100 μl，用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。棄液，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。每孔再加入顯色劑A50μl和顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色 15 min.最后每孔加終止液 50 μl終止反應（此時藍色立轉黃色）。以空白孔調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值），根據標準曲線（Y=0.0019x+0.0186，R2=0.9906）計算樣品的TNF-α含量，結果以pg/mgpro表示。

1.3統計學分析" 采用IBMSPSS Statistics 25統計軟件分析，計量資料使用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析法，Plt;0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1不同濃度的蛋清致炎效果的比較" 50%蛋清和蛋清原液在致炎后1、2和4 h大鼠的足跖腫脹度高于同一時間的10%蛋清組（Plt;0.05）;蛋清原液組的足跖腫脹度與同一時間的50%蛋清比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05）。隨著致炎時間的逐漸增加，各組大鼠的足跖腫脹度均在1 h達到高峰，而后逐漸下降。

2.2蛋清致大鼠足跖腫脹急性模型條件的驗證" 與對照組比較，模型組的足跖腫脹度和TNF-α含量高于對照組（Plt;0.05），大鼠后足呈現明顯的炎癥腫大;阿司匹林組的腫脹度和TNF-α含量低于模型組（Plt;0.05），大鼠后足炎癥腫脹明顯減輕，見表2，圖1～圖3。

3討論

新鮮蛋清所致大鼠足腫脹模型是一個經典的炎癥模型，于大鼠右足足跖皮下注射蛋清，可刺激局部產生大量的PGE2、組胺、丙二醛等炎性刺激物，從而誘導足跖腫脹。此模型操作簡單，致炎物質易得、無需特殊儀器檢測，常用于抗炎藥物的篩選及評價，也廣泛用于本科藥理學實驗。本實驗對該模型進行了不同濃度新鮮蛋清不同作用時間致炎效果進行探究。研究結果顯示，與同一作用時間的10%蛋清組比較，50%蛋清和蛋清原液在致炎后1、2和4 h，大鼠的足跖腫脹度均顯著升高，但50%蛋清和蛋清原液致炎效果無顯著差異。3個不同濃度新鮮蛋清致炎后，大鼠足跖腫脹度在1 h達到高峰，而后逐漸下降。注射器不好吸取蛋清原液，會堵針頭，綜合考慮致炎時間、致炎效果和注射器吸取蛋清的難易度，認為50%蛋液作用1 h為最佳的大鼠足跖腫脹模型條件。

TNF-α是一種多功能的炎性細胞因子，能激活單核巨噬細胞激發炎癥級聯反應，也能激活中性粒細胞等引起局部組織病理反應[13-15]。研究顯示[16-19]，許多疾病如心、腦缺血再灌注損傷、動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎等與TNF-α介導的炎癥反應有緊密關系。阿司匹林是經典的非甾體抗炎藥物，其可通過抑制NF-κB通路激活，從而TNF-α等炎癥因子的表達[20]。本研究采用阿司匹林作為大鼠足跖腫脹模型評價藥物，檢測大鼠足腫脹度和炎癥組織中的炎癥標志物TNF-α的含量，結果顯示，與對照組比較，50%蛋清的足跖腫脹度和TNF-α含量均顯著增高，大鼠后足呈現明顯的炎癥腫大;阿司匹林組的腫脹度和TNF-α含量均低于50%蛋清，大鼠后足炎癥腫脹明顯減輕，這提示50%濃度新鮮蛋清作用足跖1 h可成功構建大鼠足腫脹急性炎癥模型。

由實驗結果得知，新鮮蛋清所致大鼠足腫脹急性炎癥模型的最佳條件為50%濃度作用1 h，此模型條件可為抗炎藥物篩選或者藥效評價提供實驗參考。

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收稿日期：2022-06-05;修回日期：2022-06-27

編輯/肖婷婷

基金項目：徐州醫科大學課題（編號：2018KJ05）

作者簡介：孫曉晶（1983.1-），女，山東榮成人，碩士，實驗師，主要從事抑郁癥發病機制及其治療的研究

通訊作者：黃金蘭（1982.8-），女，廣西賀州人，博士，副教授，主要從事神經藥理研究