miR-134對食管鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其分子機制

摘要：目的" 探討miR-134抑制食管鱗狀細胞癌生長和轉移的分子機制。方法" 將人ESCC細胞系（TE-10）細胞分為miR-NC組和miR-134組，miR-NC組轉染陰性mimic，miR-134組轉染 miR-134 mimic;qPCR法檢測兩組細胞中miR-134的表達，CCK8法檢測兩組細胞增殖能力，細胞劃痕實驗檢測兩組細胞遷移能力，Transwell檢測兩組細胞侵襲能力，免疫印跡法檢測兩組細胞內基質金屬蛋白酶3（MMP3）和表皮因子生長受體（EGFR）蛋白的表達。結果" qPCR結果顯示，miR-134組細胞miR-134表達量高于miR-NC組（Plt;0.05）;CCK8實驗、細胞劃痕實驗和Transwell實驗結果顯示，與miR-NC組相比，miR-134組細胞相對增殖能力降低了12.72%（Plt;0.05），細胞遷移率下降了19.78%（Plt;0.05），細胞侵襲率降低了44.47%（Plt;0.05）;免疫印跡法結果顯示，miR-134組細胞MMP3和EGFR蛋白的表達均低于miR-NC組（Plt;0.05）。結論" miR-134可能通過調控MMP3和EGFR抑制TE-10細胞的增殖、遷移和侵襲。

關鍵詞：食管鱗狀細胞癌;微小RNA;基質金屬蛋白酶;表皮因子生長受體

中圖分類號：R735.1" " " " " " " " " " " " " " " " nbsp;文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2023.08.012

文章編號：1006-1959（2023）08-0059-05

Effects of miR-134 on Proliferation， Migration and Invasion of Esophageal Squamous Cell

Carcinoma Cells and its Molecular Mechanism

LI Dan，WU Wei-dong，GU Jia-sheng，TAO Zhuo-yan，FANG Ming-xing，FEI Song

（Department of Cardio-Thoracic Surgery，Guangzhou Red Cross Hospital of Jinan University，Guangzhou 510220，Guangdong，China）

Abstract：Objective" To investigate the molecular mechanism of miR-134 inhibiting the growth and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma.Methods" TE-10 cells were divided into miR-NC group and miR-134 group. The miR-NC group was transfected with negative mimic， and the miR-134 group was transfected with miR-134 mimic. The expression of miR-134 in the two groups was detected by qPCR. The proliferation ability of the two groups was detected by CCK8. The migration ability of the two groups was detected by cell scratch test. The invasion ability of the two groups was detected by Transwell. The expression of matrix metalloproteinase 3 （MMP3） and epidermal growth factor receptor （ EGFR ） protein in the two groups was detected by Western blotting.Results" The results of qPCR showed that the expression of miR-134 in miR-134 group was higher than that in miR-NC group （Plt;0.05）. The results of CCK8 assay， cell scratch assay and Transwell assay showed that compared with miR-NC group， the relative proliferation ability of miR-134 group decreased by 12.72% （Plt;0.05）， the cell migration rate decreased by 19.78% （Plt;0.05）， and the cell invasion rate decreased by 44.47% （Plt;0.05）. Western blot results showed that the expression of MMP3 and EGFR protein in miR-134 group was lower than that in miR-NC group （Plt;0.05）.Conclusion" miR-134 may inhibit the proliferation， migration and invasion of TE-10 cells by regulating MMP3 and EGFR.

Key words：Esophageal squamous cell carcinoma;microRNA;Matrix metalloproteinases;Epidermal growth factor receptor

食管癌是一種常見的上消化道惡性腫瘤，我國的90%食管癌患者為食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）[1]。食管癌的主要治療方法是手術聯合放化療，以及免疫治療和靶向治療，但各種方法的療效均不理想。據統計[2]，食管癌患者的5年生存率僅為20%。因此，深入研究食管癌生長轉移相關的分子機制，對于治療食管癌十分重要。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種非編碼RNA，近期研究發現miRNA在腫瘤中異常表達，并參與惡性腫瘤的調控[3]。miRNA通過與靶基因的信使RNA（Messenger RNA，mRNA）的3' UTR結合后降低靶基因的表達，當靶基因是促癌基因時，miRNA將發揮抑癌作用[4]。由于能夠抑制腫瘤基因的表達，因此基于miRNA的治療被認為是一種合理和潛在的靶向治療方法。研究發現[5]，miR-134在ESCC患者的腫瘤組織中低于周圍正常食管上皮組織，且在體內外均能抑制ESCC的生長。基質金屬蛋白酶3（Matrix metalloproteinase 3，MMP3）一種能夠降解細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）的蛋白質，在腫瘤的發展過程中促進腫瘤細胞在細胞和組織間轉移。曹靖等[6]發現，ESCC患者腫瘤組織中MMP3的表達水平明顯高于腫瘤旁正常組織，且MMP3的表達水平與患者預后呈明顯負相關。Cheng CL等[7]發現，miR-134通過降低MMP3的表達，在體內外抑制骨肉瘤的轉移。表皮因子生長受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一種受體型酪氨酸激酶，在許多腫瘤中過表達或發生突變，EGFR分子的活化與腫瘤的生長有密切的關系，被認為是一個有效的治療靶點[8]。孫文澤等[9]發現，在ESCC患者中，腫瘤組織中的EGFR表達水平與腫瘤惡性程度明顯相關。Qin Q等[10]發現，miR-134通過降低EGFR的表達抑制非小細胞肺癌的增殖。由于不同腫瘤中miRNA的下游靶基因可能不同，且目前在ESCC中miR-134與MMP3和EGFR的關系尚不明確。因此，本研究擬探討miR-134抑制ESCC細胞的分子機制。

1材料與方法

1.1細胞和試劑" 人ESCC細胞系（TE-10）細胞由廣州伯信生物科技有限公司（bersinbio，China）、MiR-134擬合物和對照擬合物由廣州伯信生物科技有限公司（bersinbio，China）提供，hsa-miR-134-5p mimic為UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG、mimic-NC為UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA。DMEM，HIGH GLUCOSE培養基（貨號：SH30243.01，HyClone）由美國HyClone公司提供。總RNA提取試劑盒Magzol購自上海邁跟生物科技有限公司（mgenbio，China）。miRNA 逆轉錄試劑盒（貨號：QP113）復能基因廣州復能基因有限公司。CCK-8試劑盒（品牌：40203ES60）翌圣生物科技（上海）股份有限公司。GAPDH、MMP3、EGFR抗體均由中國北京博奧森生物技術有限公司（bioss，China）提供。

1.2方法

1.2.1細胞培養與轉染" TE-10細胞使用含 10% FBS的DMEM，HIGH GLUCOSE培養基，在 37 ℃、5% CO2條件下培養。待細胞生長至約90%融合度時使用胰酶消化，按1∶3比例傳代培養，取對數生長期的細胞用于轉染或檢測。TE-10細胞分為miR-NC組和miR-134組， miR-NC組轉染陰性mimic、miR-134組轉染 miR-134 mimic，根據 HIEFF TRANSTM脂質體核酸轉染試劑說明書分別操作。

1.2.2 qRT-PCR檢測TE-10細胞中miR-134的表達" 利用Trizol試劑從TE-10細胞中提取總 RNA，NanoDrop 檢測 RNA濃度及純度，miRNA 逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA后使用QPCR檢測miR-134表達量。反應條件為：95 ℃預變性10 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40個循環。miR-134相對表達量以U6為內參照，引物序列見表1，采用2-ΔΔCt法對細胞中miR-134的表達水平進行相對定量分析。每個樣本設3個副孔，實驗重復3次。

1.2.3細胞增殖實驗" 采用CCK8法檢測細胞增殖能力。收集對數期TE-10細胞，以每孔104個細胞接種到96孔板中;37 ℃，5% CO2培養箱培養48 h。每孔加入10 μl CCK8溶液，繼續避光孵育1～2 h，終止培養;用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。重復檢測 3次取平均值。

1.2.4細胞劃痕實驗" 用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔。在孔中加入約1×106～2×106個細胞。約20 h后，待細胞長至80%左右就用槍頭比著直尺垂至于背后的橫線劃痕。用無血清培養基洗細胞2次，去處劃下的細胞，加入無血清培養基。放入37 ℃ 5% CO2培養箱，培養。按0、48 h取樣，拍照（統一視野）。實驗重復3次，根據測量結果取平均值。

1.2.5 Transwell實驗" 10 mg/ml的 Matrigel 4 ℃過夜解凍后用預冷的無血清培養基按1：3混勻;用預冷的槍頭取50 uL加入經預冷的Transwell小室底部膜的上室面，37 ℃放置30 min。將小室放入培養板中，在上室加入300 μl預溫的無血清培養基，室溫下靜置15～30 min，使基質膠再水化，再吸去剩余培養液將轉染后的細胞，用胰酶消化，制備細胞懸液，調整細胞懸液濃度，每組細胞數相同，為10×104/ml;上室中加入準備好的細胞懸液200 μl; 24孔板中加入含15%FBS血清的培養基700 μl后，將小室輕放其上;放入培養箱中培養24 h;將上室取出放入另一干凈24板孔中，用PBS清洗3遍，加入4%甲醇200 μl，固定細胞15 min，然后將其吸出，加入結晶紫200 μl染色15 min;將結晶紫吸出，加入PBS清洗2遍，用棉簽輕輕擦拭膜內面，以除去尚未遷移的細胞;隨機鏡下選取3個視野觀察、拍照、計數，根據計數結果取平均值。

1.2.6免疫印跡法檢測TE-10細胞中蛋白的表達" PBS清洗細胞3次后加入適量裂解液，于冰浴中反復用1 ml移液器吹打裂解。使用BCA試劑盒測定蛋白濃度，用裂解液調整蛋白濃度使其在同一水平。電泳后轉膜。用1×TBST洗滌。加入脫脂奶粉后封閉。分別加GAPDH、MMP3、 EGFR一抗（1∶1000）4 ℃孵育過夜。加入HRP山羊抗兔二抗IgG（1∶10 000 稀釋）室溫孵育 21 h。化學發光顯影后使用 ImageLab 圖像分析軟件測定條帶灰度值，并計算EGFR、MMP3蛋白相對表達量。實驗重復3次，蛋白相對表達量取平均值，以GAPDH為內參。

1.3統計學方法" 采用SPSS 21.0 版統計學軟件處理數據，計量資料采用（x±s）表示，行t檢驗，以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 miR-134在TE-10細胞中的表達" QPCR檢測結果顯示，在轉染后，miR-134組細胞的miR-134表達水平較miR-NC組升高（t=-13.036，Plt;0.05），見圖1。

2.2 miR-134過表達對TE-10細胞增殖、遷移和侵襲的影響" CCK8實驗、細胞劃痕實驗和Transwell實驗結果顯示;與miR-NC組相比，miR-134組細胞相對增殖能力降低12.72%（t= 4.362，Plt;0.05），見圖2，細胞遷移率下降19.78%（t=6.308，Plt;0.05），見圖3，細胞侵襲率降低44.47%（t=9.348，Plt;0.05），見圖4。

2.3 miR-134對MMP3和EGFR蛋白表達的影響" 免疫印跡結果顯示，與miR-NC組相比，miR-134組細胞中MMP3和EGFR的表達均降低（t=6.511、7.699，Plt;0.05），見圖5。

3討論

近幾年食管癌的治療雖然取得了一定的成效，但目前的治療效果仍然有很大的提升空間。因此，開發更高效的藥物治療食管癌仍然具有重大意義。miRNA是一種高度保守的非編碼RNA，大小約為22個核苷酸[11]。非編碼RNA不僅參與正常的生理調節和信號傳遞，還參腫瘤的發生發展[12]。在許多腫瘤中，miRNA表達失調[13]。由于miRNA能夠抑制腫瘤基因的表達，恢復腫瘤中異常表達的miRNA可以抑制腫瘤的進展。因此，基于miRNA的治療被認為是一種合理和潛在的靶向治療方法[14]。篩查并鑒定miR-134的靶基因有助于進一步闡明miR-134在ESCC中發生發展的分子機制。

既往的研究已明確miR-134可通過調節各種靶基因的表達來影響癌癥的發生發展進程[15]。如Yuan Y等[16]發現miR-134在ESCC癌組織中低表達，并通過下調叉頭框蛋白M1抑制ESCC細胞遷移和侵襲。Zhong BZ等[17]發現在胃癌細胞中，miR-134通過下調轉錄因子 YY1抑制細胞增殖和侵襲，并促進細胞凋亡。本研究發現，miR-134能抑制ESCC細胞的增殖、遷移和侵襲，這與之前的研究結果一致，進一步證實了miR-134可抑制ESCC的發生發展。

ESCC的惡性程度高，ESCC細胞常侵襲相鄰器官組織或經淋巴血管轉移到其他部位。因此，明確食管癌轉移的潛在機制至關重要。基底膜是一種特化的ECM，由于基底膜的存在，在一定程度上阻止了腫瘤細胞的轉移。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是可以降解ECM的蛋白酶。當腫瘤發生時，MMPs表達升高，降解細胞間的ECM，引起基底膜的破壞。因此，MMPs能夠促進腫瘤的轉移，研究基質金屬蛋白酶在腫瘤的轉移機制中十分重要。MMP3是一種特殊的MMPs，它不僅能降解細胞外基質和基底膜，還能激活多種基質金屬蛋白酶前體[18]，在腫瘤的轉移過程中發揮十分重要的作用。EGFR是表皮生長因子受體家族成員之一，是一種受體型酪氨酸激酶，在人類的各類細胞都廣泛分布，它參與組織細胞的生長增殖及發育，是調節細胞增殖、凋亡和遷移的重要信號分子，在腫瘤的發生發展過程中發揮著非常重要的功能。EGFR在大多數食管癌中高表達，與食管癌的生長有密切的關系，對EGFR過表達的食管鱗癌，抗EGFR治療具有顯著的治療效果[19]。有研究報道[9，20，21]，miR-134通過調控MMP3和EGFR抑制腫瘤的生長和轉移，因此miR-134具有靶向MMP3和EGFR治療腫瘤的潛力。本實驗檢測了MMP3和EGFR的表達水平，免疫印記結果顯示MMP3和EGFR的表達水平下調，這證實了miR-134在ESCC細胞可抑制MMP3和EGFR的表達。

本實驗也存在一些不足之處：本實驗并未在腫瘤組織中驗證分子的表達水平，僅在ESCC一種細胞水平驗證miR-134、MMP3和EGFR的表達水平和關系，需擴大細胞系進行更多的研究，miR-134調控腫瘤細胞行為的具體機制仍然有待深入研究。

綜上所述，在ESCC中，miR-134可抑制TE-10細胞增殖、遷移和侵襲，同時抑制MMP3和EGFR的表達，miR-134在ESCC細胞可能通過抑制EGFR和MMP3的表達發揮抑癌作用。

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收稿日期：2023-02-26;修回日期：2023-03-08

編輯/成森

基金項目：廣州市科技計劃項目（編號：201902010003）

作者簡介：李丹（1997.1-），男，湖南東安縣人，碩士研究生，主要從事食管癌的診治研究

通訊作者：吳偉東（1967.4-），男，廣東廣州人，博士，主任醫師，博士生導師，主要從事肺癌和食管癌等心胸外科疾病的診治研究