松蘿酸對CIA大鼠HMGB1、自噬蛋白Beclin1及炎性因子的影響

摘要：目的" 探討松蘿酸對關節炎（CIA）大鼠HMGB1、自噬蛋白Beclin1及炎性因子的影響。方法" 將72只大鼠隨機分成6組，每組12只，即空白對照組、模型對照組、陽性對照組、松蘿酸低、中、高劑量組，各組采用Ⅱ型膠原乳劑造模成CIA大鼠模型，空白對照組除外。造模結束后，用低（2 mg/kg）、中（6 mg/kg）、高（54 mg/kg）劑量組的松蘿酸進行藥物干預治療，陽性對照組給予羥氯喹（36 mg/kg），空白對照組及模型對照組予等溶劑5 ml蒸餾水灌胃。所有大鼠每天給藥1次，連續給藥28 d。末次灌胃2 h后，提取標本，觀察大鼠關節指數評分、腫脹程度測定，透射電鏡觀察細胞自噬，采用ELISA檢測HMGB1、TNF-α、IL-1、INF-γ的血清濃度水平，PCR、WB檢測蛋白HMGB1、Beclin1、Bcl-2、PI3K蛋白表達情況。結果" 模型對照組血清HMGB1、TNF-α、IL-1、INF-γ含量高于空白對照組，滑膜組織中HMGB1、Bcl-2、PI3K蛋白水平高于空白對照組，Beclin1蛋白表達量低于空白對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；松蘿酸中、高劑量組及陽性對照組HMGB1、TNF-α、IL-1、INF-γ、Bcl-2、PI3K水平低于模型對照組，Beclin1蛋白表達量高于模型對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；松蘿酸中、高劑量組抑制HMGB1、Bcl-2、PI3K表達、激活Beclin1的效果與陽性對照組比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05）。結論" 松蘿酸能減輕CIA大鼠關節腫脹程度，降低血清HMGB1、TNF-α、IL-1、INF-γ濃度，抑制HMGB1、Bcl-2、PI3K蛋白的表達，促進Beclin1表達上升，增強細胞自噬，減少滑膜炎癥反應。

關鍵詞：類風濕關節炎；HMGB1；自噬蛋白Beclin1；炎性因子；松蘿酸

中圖分類號：R539.22" " " " " " " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2023.16.014

文章編號：1006-1959（2023）16-0078-06

Effects of Ursolic Acid on HMGB1， Autophagy Protein Beclin1 and Inflammatory Factors in CIA Rats

XIE Liang-shan1，AN Yang2，ZHANG Jun2，HUANG Ying2，PAN Xiao-yi2，XU Hui2

（1.The Second Clinical Medical College of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，Guizhou，China;

2.Department of Rheumatology and Immunology，Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550001，Guizhou，China）

Abstract：Objective" To explore the effect of ursolic acid on HMGB1， autophagy protein Beclin1 and inflammatory factors in CIA rats.Methods" A total of 72 rats were randomly divided into 6 groups， with 12 rats in each group： blank control group， model control group， positive control group， low dose grou， middle dose group and high dose group. CIA rats were induced by type Ⅱ collagen emulsion in each group， except the blank control group. After the establishment of the model， the rats in the low （2 mg/kg）， middle （6 mg/kg） and high （54 mg/kg） dose groups were treated with ursolic acid， the positive control group was given hydroxychloroquine （36 mg/kg）， and the blank group and model group were given 5 ml distilled water. All rats were given the drug once a day for 28 days. Two hours after the last intragastric administration， the specimens were extracted， and the joint index score， swelling degree and autophagy were observed under transmission electron microscope. The serum concentrations of HMGB1， TNF-α， IL-1 and INF-γ were detected by ELISA， and the protein expressions of HMGB1， Beclin1， Bcl-2 and PI3K were detected by PCR and WB.Results" The levels of serum HMGB1， TNF-α， IL-1 and INF-γ in the model control group were higher than those in the blank control group， the levels of HMGB1， Bcl-2 and PI3 K protein in synovial tissue were higher than those in the blank control group， and the expression of Beclin1 protein was lower than that in the blank control group， the difference was statistically significant （Plt;0.05）. The levels of HMGB1， TNF-α， IL-1， INF-γ， Bcl-2 and PI3K in the middle and high dose groups of usnic acid and the positive control group were lower than those in the model control group， and the expression of Beclin1 protein was higher than that in the model control group， the differences were statistically significant （Plt;0.05）. There was no significant difference in the effect of inhibiting the expression of HMGB1， Bcl-2， PI3 K and activating Beclin1 between the middle， high dose groups of usnic acid and the positive control group （Pgt;0.05）.Conclusion" Ursolic acid can reduce the degree of joint swelling in CIA rats， decrease the concentration of serum HMGB1， TNF-α， IL-1 and INF- γ， inhibit the expression of HMGB1， Bcl-2 and PI3K protein， increase the expression of Beclin1， enhance autophagy and reduce synovial inflammation.

Key words：Rheumatoid arthritis;HMGB1;Autophagy protein Beclin1;Inflammatory factor;Ursolic acid

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的以對稱性、侵蝕性關節炎為主的慢性自身免疫性疾病，其發病率高、致殘率大、分布廣，以血管翳的形成、滑膜炎的產生、關節軟骨和骨質的破壞為特征。研究發現[1]，細胞自噬在RA的發病中具有重要作用，HMGB1是重要的細胞自噬調節基因，通過調節自噬蛋白Beclin1等的表達從而影響疾病進展，促進炎癥因子的活化和增殖，加重炎癥持續。并活化核轉錄因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號，激活下游炎性因子HMGB1、TNF-α、IL-1、INF-γ的表達，放大免疫反應，誘發關節炎癥。因此，通過調節相關的自噬蛋白及炎性因子，可能是治療RA的潛在靶點。目前，民族醫藥在治療RA上有一定的優勢，侗醫藥松蘿，其主要藥理活性成份是松蘿酸，具有祛風除濕、通絡止痛的功效。近年來研究證實，松蘿具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、鎮痛等一系列生物活性，對治療RA等炎癥性疾病都具有良好的治療效果，可有效控制炎癥，減輕相應的臨床癥狀。本課題組前期研究證實松蘿制劑對RA的治療具有良好療效[2]，但松蘿酸是否參與影響HMGB1、自噬蛋白Beclin1及相關炎性因子的表達情況尚未得到驗證。因此，本研究通過觀察松蘿酸對CIA大鼠HMGB1、自噬蛋白Beclin1及炎性因子的影響，探討松蘿酸對治療RA的作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物" SPF級5周齡Wistar雌性大鼠72只（由湖北省實驗動物研究中心提供），體質量160～180 g，免檢合格。合格證號：SCXK（鄂）2022-0018；實驗室清潔環境喂養，室溫適宜，喂養1周后開始造模。

1.2主要藥品及試劑" 松蘿酸（Solarbio，IU0130）、羥氯喹（Solarbio，IH0720）、膠原蛋白（源葉生物，S24940）、弗氏佐劑（SIGMA，F5881-6X）、全自動酶標儀（ Thermo scientific，Multiskan MK3）、PCR 儀（東勝創新生物科技有限公司，EDC-810）、實時熒光定量PCR儀（ABI，QuantStudio 6）、熒光定量PCR管（EXTRAGENE/illumina）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天，P0010）、RIPA裂解液（碧云天，P0013B）、磷酸酶抑制劑（碧云天，S1873）等。

1.3方法

1.3.1分組與造模" 將72只大鼠編號后隨機分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組、松蘿酸低、中、高劑量組6組，每組12只，按照參考文獻建立模型，將膠原蛋白溶解于0.1 M的冰醋酸，配制成1 mg/ml的溶液，于4 ℃冰箱內過夜后，加入等體積的完全弗氏佐劑（CFA），置于注射器中，于冰上反復推拉充分混勻，制成0.5 mg/ml的混合溶液，錫紙包裹以免曝光，4 ℃冰箱保存，現用現配。將大鼠置于呼吸機麻醉后，于大鼠尾根部，背部及足墊多點皮下注射配制好的膠原蛋白溶液，劑量為0.3 ml/100 g。初次免疫1周后按照相同劑量再加強免疫1次，建立穩定的CIA大鼠模型[3]。空白對照組大鼠皮下注射生理鹽水。

1.3.2給藥" 造模后第3天開始給藥，空白對照組、模型對照組給予蒸餾水5 ml/只灌胃；松蘿酸低、中、高劑量組分別予2、6、54 mg/（kg·d）灌胃，陽性對照組36 mg/（kg·d），連續4周。

1.3.3標本采集" 末次給藥后，以0.4 ml/100 g的烏拉坦溶液進行腹腔注射，麻醉后于股動脈取血4～6 ml，通過靜置30 min后，3000 r/min離心15 min，制備血清。處死大鼠后，解剖大鼠膝關節組織分離滑膜組織，分別于2.5%戊二醛溶液固定、-80 ℃凍存以及4%多聚甲醛固定，用于后續病理切片檢測。

1.4觀察指標

1.4.1模型關節炎評分" 造模后觀察大鼠關節紅腫程度，對每只大鼠關節進行炎癥評分，關節炎指數評分標準：無紅腫為0分；小趾關節輕度紅腫為1分；小趾關節和足跖腫脹為2分；踝關節下指甲腫脹為3分；所有指甲、關節腫脹為4分。四肢關節得分總和為該大鼠總評分，大于4分為造模成功，最高為16分[4]。

1.4.2 血清HMGB1、TNF-α、IL-1、INF-γ水平檢測" 用ELISA法檢測，按照ELISA試劑盒說明進行操作，加入標準品和待測樣品，設置陰性對照，37 ℃反應 30 min 溫育，洗板 5 次，加入酶標試劑，37 ℃反應，再洗板 5 次，每孔加入顯色劑，酶標板加上覆膜36 ℃避光孵育15 min。后加入終止液，立即用酶標儀測量各孔的光密度（OD值），進行計算，取平均值。

1.4.3關節滑膜組織中HMGB1、Bcl-2、PI3K、Beclin1蛋白濃度檢測" 采用Western Blotting法檢測，將組織低溫勻漿后加入裂解液，裂解30 min，4 ℃下12000 rpm的條件下離心10 min，取上清。將蛋白樣品以BSA為標準品進行稀釋，每孔加入20 μg蛋白樣品，SDS-PAGE電泳分離1.5 h后，開始轉膜，用封閉液稀釋相應的一抗，洗膜后添加二抗（1：50 000），反復洗膜5次后，放入顯影液顯影、定影液定影，用Western blotting印跡觀察，用圖像分析測定各帶吸光度（A）值作定量分析。

1.4.4關節滑膜組織中HMGB1、Bcl-2、PI3K、Beclin1 mRNA表達檢測" 采用RT-PCR法檢測，提取總RNA，裂解、離心，逆轉錄合成cDNA，反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個循環。引物設計見表1。

1.4.5透射電鏡觀察細胞自噬" 將待觀察細胞經離心、洗滌、戊二醛固定、鋨酸固定、丙酮梯度脫水、浸泡、包埋、修塊、定位、切片、染色后，在透射電鏡下觀察細胞自噬小體和自噬泡的形成。

1.5 統計學方法" 采用SPSS 26.0統計軟件分析數據，所有數據先進行正態性檢驗，符合正態分布的計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，Plt;0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1松蘿酸對大鼠關節癥狀的影響" 空白對照組的大鼠無關節紅腫、變形，活動量減少等癥狀，而其他各組大鼠出現關節紅腫、變形，活動量減少，甚至畸形的癥狀，評分為（4.38±0.74）分，提示造模成功。經過松蘿酸與羥氯喹干預治療后，上述癥狀均得到緩解。松蘿酸低劑量組的評分為（3.00±0.75）分，松蘿酸中劑量組的評分為（2.25±0.88）分，松蘿酸高劑量組的評分為（1.75±0.71）分，陽性對照組的評分為（1.63±0.74）分。

2.2各組大鼠血清HMGB1、TNF-α、IL-1、INF-γ含量比較" 與空白對照組相比，其他各組大鼠血清HMGB1、TNF-α、IL-1、INF-γ含量上升（Plt;0.05），提示造模成功；與模型對照組相比，松蘿酸低、中、高劑量組及陽性對照組血清HMGB1、TNF-α、IL-1、INF-γ含量均下降（Plt;0.05）；松蘿酸中、高劑量組治療效果與陽性對照組比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05），見表2。

2.3各組大鼠關節滑膜組織中HMGB1、Bcl-2、PI3K、Beclin1 mRNA表達比較" 與空白對照組相比，松蘿酸低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽性對照組及模型對照組HMGB1、Bcl-2、PI3K、Beclin1均增加，Beclin1下降，差異有統計學意義（Plt;0.05）；與模型對照組相比，松蘿酸中、高劑量組及陽性對照組均能激活Beclin1，下調HMGB1、Bcl-2、PI3K蛋白表達，差異有統計學意義（Plt;0.05）；與陽性對照組相比，松蘿酸中、高劑量組與其效果相當，差異無統計學意義（Pgt;0.05），見表3、圖 1。

2.4各組大鼠關節滑膜組織中HMGB1、Bcl-2、PI3K、Beclin1表達比較" 與空白對照組相比，模型對照組、松蘿酸低、中、高劑量組及陽性對照組滑膜組織中HMGB1、Bcl-2、PI3K蛋白相對表達量水平增高，Beclin1相對下降，差異有統計學意義（Plt;0.05）；與模型對照組相比，松蘿酸中、高劑量組及陽性對照組HMGB1、Bcl-2、PI3K蛋白相對表達量下降，Beclin1增加，差異有統計學意義（Plt;0.05）；松蘿酸中、 高劑量組蛋白表達與陽性對照組比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05），見表4、圖2。

2.5關節滑膜組織中細胞自噬病理變化比較" 與空白對照組相比，模型對照組、松蘿酸低劑量組自噬體數量稍增加，自噬體數量相對較少，維持正常需求，松蘿酸中、高劑量組及陽性對照組自噬小體數量明顯增加；炎癥細胞因子減少，細胞凋亡增加，提示松蘿酸及羥氯喹皆能促進細胞自噬，從而達到抑制滑膜細胞產生炎癥的機制，見圖3。

3討論

RA的病因較為復雜，且發病機制研究尚不清楚，臨床表現為關節炎癥反應及免疫缺陷，血清學檢查總表現為相關抗體陽性。RA發生時，滑膜組織細胞內的炎癥因子種類及數量相對增加，機體在免疫機制的作用下出現異常的表達。臨床研究發現，TNF-α、IL-1、INF-γ在RA患者血清表達中普遍增高，對疾病的發生及轉歸有一定程度的影響，可通過調控細胞信號通路來釋放炎癥及相關的免疫抗體，達到干預炎癥反應的效果[5，6]。HMGB1是一種核蛋白，更是重要的血清致炎因子，在RA疾病進展中有著重要的促進作用，HMGB1在滑膜組織、滑液甚至血清中表達水平都有顯著升高[7]；同時，HMGB1在RA的疾病進程中對調節免疫反應、炎癥以及自噬具有重要作用[8]。HMGB1位于細胞核內，當組織發生炎癥刺激，或細胞凋亡、壞死以及免疫細胞活化等情況下，核內的HMGB1可被釋放至細胞核外[9]，與TNF-α、IL-1、INF-γ等炎癥因子形成正向炎性反饋通路，刺激血管內皮細胞及單核巨噬細胞釋放HMGB1，促使TNF-α、IL-1、INF-γ分泌，使炎癥反應得以維持[10]。另外，當HMGB1與IL-1、核小體或脂多糖（LPS）等結合后形成聚合物，再與相關受體結合，促進炎性細胞的趨附性及IL-17、IL-6、IL-23等的分泌，刺激NF-κB炎性通路活化，誘導TNF-α、IL-1等致炎因子釋放，加重炎癥反應狀態，導致RA的發生發展[11]。自噬蛋白Beclin1在機體炎癥反應及過程中發揮重要作用[12]。研究表明[13]，核內HMGB1轉移至細胞質直接與自噬因子Beclin1結合，將Beclin1從凋亡抑制因子Bcl-2中分離，通過促進BECN1和Ⅲ型磷酸肌醇3激酶（Ptdlns3KC3，PI3K Class Ⅲ）/Vsp34結合，激活自噬。還可以激活細胞外調節蛋白激酶（ERK），進一步激活死亡相關蛋白激酶（DAPK），促使Beclin1磷酸化，誘導Beclin1與Bcl-2分離，調節自噬的水平[14]。由此表明，HMGB1可與Beclin1特異性結合，共同作用于炎癥反應的表達。

侗族醫學認為，RA屬于“風濕痛”范疇，其病因病機是機體蘊生“邪熱”所致，疼痛乃邪熱蘊阻關節之外像。本課題組[15]提出RA活動期的治療以清郁熱為主，其熱之所生，是由于外邪、情志、內傷等因素，致氣機閉郁，經絡痹阻，導致內生邪熱，氣血津液運行不暢，腐壞關節、組織。侗醫名家吳定元著《草木春秋》中也提出“趕邪、消水”的治法。侗醫藥松蘿性味甘、平，具有除濕通絡、清熱解毒之功，可治風濕痹痛、跌打損傷。前期的預試驗研究顯示松蘿提取物可以抑制CIA大鼠關節滑膜細胞中HMGB1、TNF-α、INF-γ、IL-1的表達水平，進一步的實驗研究顯示松蘿制劑可以降低CIA大鼠血清IL-1、IL-1β、TNF-α的分泌水平[16]，有效控制關節滑膜炎癥。

本研究顯示，空白對照組大鼠關節無紅腫、變形，活動量正常。CIA大鼠造模成功后，模型大鼠的關節發生了明顯的炎性變化，關節發生紅腫、變形，活動量下降，炎癥因子HMGB1、TNF-α、INF-γ、IL-1的表達水平升高。松蘿酸中、高劑量組及陽性對照組大鼠經干預治療后癥狀減輕，下調了HMGB1、TNF-α、INF-γ、IL-1的表達水平，減輕了炎癥反應，說明炎癥時自噬是抑制狀態，松蘿酸及羥氯喹對促進自噬具有相同的作用，從而在機體內產生抑制炎癥反應的效果。本研究結果還發現，造模后CIA大鼠滑膜組織中HMGB1、Bcl-2、PI3K蛋白表達上升，Beclin1下降（Plt;0.05），同時通過松蘿酸、羥氯喹干預治療后，松蘿酸中、高劑量組及陽性對照組大鼠滑膜組織中HMGB1、Bcl-2、PI3K蛋白表達下降，Beclin1上升（Plt;0.05），說明松蘿酸可有效降低CIA大鼠機體內的炎癥因子表達，進一步調控自由基的釋放，抑制炎癥反應。這也說明HMGB1、Beclin1及其調劑機制可能與RA的發生發展具有一定的相關性，證實松蘿酸可下調炎癥指標，延緩RA的進程。

綜上所述，松蘿酸可通過調控CIA大鼠HMGB1、自噬蛋白Beclin1等蛋白及炎性因子的表達，控制CIA大鼠炎性反應過程。

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收稿日期：2022-09-27；修回日期：2022-10-08

編輯/成森