膿毒癥患者發生急性肺損傷的機制和生物標記物研究

摘要：目的" 探索膿毒癥患者發生急性肺損傷的發病機制和生物標記物。方法" 利用R語言在GEO數據庫中篩選膿毒癥和膿毒癥合并急性肺損傷患者兩組轉錄組數據集的差異基因，利用String數據庫構建差異基因蛋白-蛋白相互作用網絡，利用Cytoscape軟件鑒定樞紐基因，利用R語言分析樞紐基因在兩組數據集mRNA的相對表達和表達相關性；利用miRTarBase數據庫和NetworkAnalys網站構建miRNA-gene網絡，篩選與樞紐基因作用的miRNA，利用CIBERSORTx網站對兩組數據集進行免疫細胞浸潤評估，利用CTD數據庫搜索與膿毒癥合并急性肺損傷相關的生物標記物作用的分子化合物，以預測膿毒癥合并急性肺損傷的治療藥物。結果" 共鑒定出差異基因12個，其中3個表達上調，9個表達下調；膿毒癥患者發生急性肺損傷機制與細胞周期縮短、細胞凋亡增加、細胞鐵死亡增加相關；樞紐miRNA miR-335-5p和樞紐基因CDKN1A可能是膿毒癥合并急性肺損傷與發病機制相關的重要生物標記物和靶向治療標記物，共有687種分子化合物與CDKN1A作用，發揮上調其表達的作用。結論" miR-335-5p和CDKN1A可能是膿毒癥合并急性肺損傷潛在的與發病機制相關的重要生物標記物。

關鍵詞：膿毒癥；急性肺損傷；生物標記物；CDKN1A；microRNA-335-5p

中圖分類號：R563" " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2023.16.001

文章編號：1006-1959（2023）16-0001-07

Study on the Mechanism and Biomarkers of Acute Lung Injury in Patients with Sepsis

YUAN Mu，XING Wei，XU Xiang

（Central Laboratory of Daping Hospital，Army Medical University，Chongqing 400042，China）

Abstract：Objective" To explore the pathogenesis and biomarkers of acute lung injury in patients with sepsis.Methods" The GEO database was used to screen the differential genes in the transcriptome datasets of sepsis and sepsis with acute lung injury using R language; the differential gene protein-protein interaction network was constructed using the String database; the key genes were identified using Cytoscape software; R language was used to analyze the relative expression and expression correlation of hub gene mRNA in the two data sets; the miRNA-gene network was constructed using the miRTarBase database and the NetworkAnalys website to screen the miRNAs that interact with the hub genes. The CIBERSORTx website was used to evaluate the immune cell infiltration of the two sets of data sets. The CTD database was used to search for molecular compounds related to biomarkers associated with sepsis complicated with acute lung injury to predict the therapeutic drugs for sepsis complicated with acute lung injury.Results" A total of 12 differential genes were identified， of which 3 genes were up-regulated and 9 genes were down-regulated; the mechanism of acute lung injury in patients with sepsis was related to shortened cell cycle， increased apoptosis， and increased ferroptosis; the hub miRNA miR-335-5p and the hub gene CDKN1A might be important biomarkers and targeted therapeutic markers related to the pathogenesis of sepsis complicated with acute lung injury. A total of 687 molecular compounds interacted with CDKN1A and played a role in up-regulating its expression.Conclusion" miR-335-5p and CDKN1A may be potentially important biomarkers related to the pathogenesis of sepsis patients with acute lung injury.

Key words：Sepsis;Acute lung injury;Biomarker;CDKN1A;microRNA-335-5p

膿毒癥（sepsis）是對感染反應失調導致的器官功能障礙綜合癥，主要表現為寒戰、發熱或低體溫、心慌、氣促、精神狀態改變等癥狀[1]。有研究報道[2]，膿毒癥患者可能合并急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。膿毒癥和膿毒癥合并ALI早期癥狀相似且難以鑒別，所以膿毒癥合并ALI的早期發現以預防其發展為ARDS十分重要。但目前發現的診斷標記物很少且缺乏臨床驗證，膿毒癥發生ALI的機制尚不十分明了，缺少針對性的治療策略，所以進一步探索早期預警標記物、發病機制和治療靶點，改善治療方法尤為重要[3，4]。研究發現[5]，膿毒癥和膿毒癥合并ALI的鑒別診斷生物標記物可能為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（CDKN1A）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1C（CDKN1C），但其缺乏后續臨床驗證，目前尚沒有鑒別診斷金標準標記物。研究發現[6]，抑制粘蛋白1（Mucin1）可加重膿毒癥引起的ALI，其血漿中的水平對膿毒癥患者是否會發展為ARDS具有良好的預測作用，然而由于受試樣本量的限制，其還未在臨床中廣泛應用。高通量測序是一種能夠對大量核酸分子進行序列測定并識別的技術，目前已經廣泛應用于疾病生物標記物的探索[7]。生物信息學分析可從核酸和蛋白質序列出發，分析序列中表達的結構和功能的生物和臨床信息[8]。非侵入性外周血生物標記物篩查是一種靈敏、快速、簡易的檢查手段，已用于許多疾病的診斷，其中microRNA（miRNA）可作為外周血生物標記物，其敏感性和穩定性較高，在早期可檢測出其變化，已作為診斷和治療的重要生物標記物[9]。本研究通過基因表達綜合數據庫（gene expression omnibus，GEO）對膿毒癥及膿毒癥合并ALI臨床外周全血RNA高通量測序數據集生物信息學分析，探索膿毒癥ALI的發病機制及相關重要生物標記物，旨在為膿毒癥ALI的發病機制提供理論基礎，現報道如下。

1資料與方法

1.1數據集預處理和差異表達基因鑒定" 檢索GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）后下載膿毒癥和膿毒癥合并ALI數據集GSE10474。數據集GSE10474為入住重癥病房后48 h內接受機械通氣并取外周血的患者，且符合重癥醫學會共識聲明定義的敗血癥標準以及AECC對ALI的定義。共包含13個膿毒癥和21個膿毒癥合并ALI的外周全血RNA樣本[10，11]，所有樣本經過高通量測序。利用R軟件的“Limma”包識別數據集差異表達基因（DEGs），使用“ggplot2”包制作火山圖，使用“pheatmap”包將制作熱圖，P.adjlt;0.05和|Log2FC|gt;1的基因被定義為DEGs。

1.2 DEGs功能注釋和相關通路富集分析" 使用R軟件“clusterProfiler”包對DEGs進行GO和KEGG富集分析，Plt;0.05、FDRlt;0.05被認為富集結果有意義。

1.3 DEGs的蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡分析和樞紐基因相對表達及相關性鑒定" DEGs的PPI分析采用String數據庫（https：//cn.string-db.org/）進行，String數據庫是預測蛋白質相互作用的數據庫[12]。使用置信值gt;0.4識別PPI簇，用“igraph”包繪制PPI網絡圖。樞紐基因通過“boxplot”包繪制箱線圖比較兩組樞紐基因相對表達情況；多基因相關性圖通過R軟件包“pheatmap”進行繪制。使用“Spearman”相關性分析來描述定量變量之間的相關性[13]，Plt;0.05被認為差異有統計學意義。

1.4樞紐miRNA的鑒定" 使用NetworkAnalys3.0（https：//www.networkanalyst.ca/）網站關聯的miRTarBase v8.0數據庫鑒定與樞紐基因作用的miRNA網絡并通過Cytoscape3.7.2軟件繪制miRNA-gene網絡圖，與樞紐基因作用數量多的miRNA為樞紐miRNA[14]。

1.5 Lasso -Cox回歸預測診斷標記物及樞紐基因受試者工作特征（ROC）曲線評價其診斷效能" 使用“glmnet”包進行Lasso-Cox回歸分析，構建疾病診斷模型，對診斷標記物進行預測[15]。使用“pROC”包對數據集的樞紐基因進行ROC曲線分析，并使用“ggplot2”包對結果進行可視化，曲線下面積（AUC）gt;0.7的基因被認為是膿毒癥和膿毒癥合并ALI的鑒別診斷基因。

1.6免疫細胞浸潤評價" 上傳基因表達矩陣GSE52209至CIBERSORTx（https：//cibersortx.stanford.edu/）網站，通過CIBERSORT算法獲得樣本的22種免疫細胞浸潤評分矩陣，使用“ggplot2”包繪制免疫細胞浸潤百分比直方圖及兩組樣本免疫細胞浸潤差異箱式圖。

1.7 作用于樞紐基因的藥物鑒定" 使用毒性與基因比較數據庫（CTD，http：//ctdbase.org/）找到與樞紐基因作用的分子化合物。

2結果

2.1 DEGs鑒定" 共識別12個DEG，其中3個DEG上調，9個DEG下調，見表1、圖1。

2.2 DEGs的功能和分子通路富集分析" DEGs在生物學過程方面主要富集于細胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性負調控等生物學過程，分子功能方面主要富集于細胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑活性、DNA損傷反應、p53類分子的信號轉導導致p21類分子轉錄、細胞鐵離子穩態、p53類分子介導的內在凋亡信號通路等；KEGG分析顯示：DEGs主要富集于細胞周期、甲狀旁腺激素的合成、分泌和作用、神經膠質瘤形成、催產素信號通路等通路，見圖2。

2.3 PPI網絡構建與樞紐基因的鑒定" 根據String數據庫和Cytoscape軟件，對DEGs分別進行PPI網絡構建和中樞基因的篩選，確定CDKN1A、CDKN1C和組蛋白簇1 H4家族成員H（HIST1H4H）為數據集的樞紐基因，其中CDKN1A和CDKN1C與HIST1H4H都有作用，為膿毒癥發生ALI的樞紐基因，CDKN1A可能在膿毒癥ALI的發生中發揮重要作用，見圖3。

2.4樞紐基因的相對性表達和表達相關性" 與膿毒癥組相比，膿毒癥合并ALI組CDKN1A、CDKN1C和HIST1H4H mRNA表達均下調；CDKN1A與CDKN1C和HIST1H4H的mRNA表達呈正相關，見圖4。

2.5 miRNA-gene調控網絡的構建" 3個中樞基因及其調控miRNA網絡見圖5，與CDKN1A作用的miRNA共有331個，與CDKN1C作用的miRNA共有8個，其中hsa-mir-335-5p與CDKN1A和CDKN1C都有作用，has-mir-335-5p可能是膿毒癥發生ALI機制中發揮作用的重要分子標記物。

2.6診斷標志物的篩選和驗證" 使用Lasso-Cox回歸算法從DEGs中識別出CDKN1A可能作為膿毒癥與膿毒癥合并ALI的鑒別診斷標志物，為了評估CDKN1A的診斷效用，繪制ROC曲線進行數據集內部驗證，計算AUC，CDKN1A基因的AUC為0.82gt;0.7。因此，樞紐基因CDKN1A作為一種外周血生物標志物具有較高的鑒別診斷價值，見圖6。

2.7免疫細胞浸潤的評價" 使用CIBERSORT算法進行免疫細胞浸潤分析，兩組樣本22種免疫細胞浸潤百分比無差異（圖7A），兩組樣本免疫細胞浸潤差異箱式圖顯示兩組樣本整體上22種免疫細胞浸潤無差異（圖7B）。

2.8 作用于樞紐基因藥物的鑒定" 結合GO和KEGG分析結果，CDKN1A的降低與細胞周期縮短、細胞凋亡和細胞鐵死亡增強相關，在CTD數據庫中共檢索到687種分子化合物作用于CDKN1A，使其表達上調。

3討論

研究表明膿毒癥患者ALI引起ARDS的可能性大大增加，ARDS合并感染治療不正確或存在混合感染會使療程延長，這是導致膿毒癥患者合并ARDS死亡的重要原因之一[16-18]。膿毒癥可導致ALI，肺部是膿毒癥患者較容易浸潤的部位[19]，所以膿毒癥合并ALI的早期預警十分重要。

本研究通過生物信息學分析探索了膿毒癥合并ALI的發病機制和相關生物標記物，GO和KEGG富集分析顯示膿毒癥合并ALI的發病可能與細胞凋亡和鐵死亡密切相關，差異基因分析得出12個差異基因，其中3個基因上調，9個基因下調。PPI網絡構建分析得出CDKN1A為樞紐基因，通過miRNA-gene作用識別作用于樞紐基因的miRNA，其中miR-335-5p既作用于CDKN1A又作用于CDKN1C，為樞紐miRNA。由以上分析得出CDKN1A和miR-335-5p對膿毒癥合并ALI的發病有重要作用，可能為疾病治療的重要靶點。

目前研究表明[20-22]，上調CDKN1A有利于細胞分化和遷移，可導致多種半胱天冬酶和凋亡效應物的抑制，抑制細胞凋亡。CDKN1A可促進細胞周期停滯和細胞衰老[23]，可通過與增殖細胞核抗原（PCNA）結合抑制細胞增殖[24]。綜合以上CDKN1A的作用結合數據集富集分析結果可知，與單獨膿毒癥患者相比，膿毒癥合并ALI患者CDKN1A降低可能與細胞分化和遷移減弱相關，細胞周期縮短導致凋亡增加。近幾年有研究表明慢性阻塞性肺疾病外周血、肺組織、肌肉樣本中CDKN1A mRNA高表達可能在慢性阻塞性肺疾病（COPD）的發生發展過程中發揮重要指示作用，其中CDKN1A主要發揮使細胞衰老的作用[25，26]。近幾年有研究表明[27]，CDKN1A和禽肉瘤病毒17轉化基因（JUN）可能是缺血性卒中與鐵死亡相關的聯合診斷標記物。鐵死亡是近幾年的熱門研究領域，是由于氧化劑和抗氧化劑產生異常引起的氧化還原失衡引起的，它產生的原因主要是產生或代謝自由基和脂質氧化產物的多種氧化還原活性酶的異常表達和活性失常。Chen R等[28]研究表明，CDKN1A是鐵死亡相關基因且其表達增多可抑制鐵死亡，P53可通過增強CDKN1A的表達抑制鐵死亡，但目前其具體機制不明，這與上述GO分析結果相一致，說明膿毒癥合并ALI可能與細胞鐵死亡密切相關。DEGs中上調基因CYBRD1也與鐵死亡的發生呈正相關，其機制包括增加鐵的攝取和激活鐵死亡相關通路[29]。

有研究表明[30，31]，miR-335-5p在膿毒癥中發揮抗炎作用且其在膿毒癥發生死亡中發揮重要作用。過表達miR-335-5p會增強自噬[32]，減輕炎癥反應[33，34]，抑制細胞增殖、侵襲、遷移和的上皮間充質轉化[35]。miR-335-5p過表達通過降低重組人Dickkopf相關蛋白-1（DKK1）的蛋白表達水平來抑制高糖誘導的小鼠胚胎成骨細胞前體細胞（MC3T3-E1）凋亡[36]。miR-335-5p通過抑制VASH1增強胰島素抵抗并抑制胰島β細胞分泌，最終激活妊娠期糖尿病小鼠的TGF-β通路。miR-335-5p也可介導急性冠脈綜合征中Notch信號通路的抑制，使易損斑塊減少，膠原纖維含量增加。miR-335-5p可調節鐵死亡相關基因。有報道表明miR-335可通過靶向鐵蛋白重鏈1促進帕金森病患者的細胞鐵死亡，所以miR-335-5p也有調控鐵死亡的作用。

本研究的局限性：只探索了樞紐基因和miRNA的功能和臨床價值，其他差異基因的功能和作用未做進一步探索；肺炎也可能引起膿毒癥，本研究并未討論膿毒癥引起ALI和肺炎引起ALI后導致膿毒癥的機制差異，只討論了兩種疾病狀態的差異及機制，因疾病因引起的差異及機制仍需進一步研究。

綜上所述，膿毒癥合并ALI相對膿毒癥患者細胞凋亡、細胞鐵死亡增加，免疫細胞浸潤無明顯變化。CDKN1A和miR-335-5p這兩個外周血生物標記物可能在膿毒癥患者ALI的發生中發揮重要作用，可能作為臨床中膿毒癥患者發生ALI的潛在治療靶點。

參考文獻：

[1]Rudd KE，Johnson SC，Agesa KM，et al.Global， regional， and national sepsis incidence and mortality， 1990-2017：" analysis for the Global Burden of Disease Study[J].Lancet，2020，395（10219）：200-211.

[2]Srzic I，Nesek AV，Tunjic PD.Sepsis Definition： What's New ？In The Treatment Guidelines[J].Acta Clin Croat，2022，61（Suppl 1）：67-72.

[3]Wang Z，Rui T，Yang M，et al.Alveolar macrophages from septic mice promote polymorphonuclear leukocyte transendothelial migration via an endothelial cell Src kinase/NADPH oxidase" pathway[J].J Immunol，2008，181（12）：8735-8744.

[4]Kumar V.Pulmonary Innate Immune Response Determines the Outcome of Inflammation During" Pneumonia and Sepsis-Associated Acute Lung Injury[J].Front Immunol，2020，11：1722.

[5]Howrylak JA，Dolinay T，Lucht L，et al.Discovery of the gene signature for acute lung injury in patients with sepsis[J].Physiol Genomics，2009，37（2）：133-139.

[6]Wang YM，Qi X，Gong FC，et al.Protective and predictive role of Mucin1 in sepsis-induced ALI/ARDS[J].Int Immunopharmacol，2020，83：106438.

[7]Rego SM，Snyder MP.High Throughput Sequencing and Assessing Disease Risk[J].Cold Spring Harb Perspect Med，2019，9（1）：a026849.

[8]Oliver GR，Hart SN，Klee EW.Bioinformatics for clinical next generation sequencing[J].Clin Chem，2015，61（1）：124-135.

[9]Ho P，Clark IM，Le LTT.MicroRNA-Based Diagnosis and Therapy[J].Int J Mol Sci，2022，23（13）：7167.

[10]Bone RC，Balk RA，Cerra FB，et al.definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use" of innovative therapies in sepsis[J].Crit Care Med，1992，20（6）：864-874.

[11]Bernard GR，Artigas A，Brigham KL，et al.The American-European Consensus Conference on ARDS. Definitions， mechanisms，" relevant outcomes， and clinical trial coordination[J].Am J Respir Crit Care Med，1994，149（3 Pt 1）：818-824.

[12]Szklarczyk D，Gable AL，Nastou KC，et al.The STRING database in 2021： customizable protein-protein networks， and" functional characterization of user-uploaded gene/measurement sets[J].Nucleic Acids Res，2021，49（D1）：D605-D612.

[13]Pripp AH.Pearson's or Spearman's correlation coefficients[J].Tidsskr Nor Laegeforen，2018，138（8）.

[14]Huang HY，Lin YC，Cui S，et al.miRTarBase update 2022： an informative resource for experimentally validated" miRNA-target interactions[J].Nucleic Acids Res，2022，50（D1）：D222-D230.

[15]Tibshirani R.The lasso method for variable selection in the Cox model[J].Stat Med，1997，16（4）：385-395.

[16]Chen L，Heikkinen L，Wang C，et al.Trends in the development of miRNA bioinformatics tools[J].Brief Bioinform，2019，20（5）：1836-1852.

[17]Li S，Han F，Qi N，et al.Determination of a six-gene prognostic model for cervical cancer based on WGCNA" combined with LASSO and Cox-PH analysis[J].World J Surg Oncol，2021，19（1）：277.

[18]Fan E，Fan J.Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation[J].Respir Res，2018，19（1）：50.

[19]Guerrero-Fonseca IM，García-Ponce A，Vadillo E，et al.HS1 deficiency protects against sepsis by attenuating neutrophil-inflicted lung" damage[J].Eur J Cell Biol，2022，101（2）：151214.

[20]Abbas T，Dutta A.p21 in cancer： intricate networks and multiple activities[J].Nat Rev Cancer，2009，9（6）：400-414.

[21]Kreis NN，Louwen F，Yuan J.Less understood issues： p21（Cip1） in mitosis and its therapeutic potential[J].Oncogene，2015，34（14）：1758-1767.

[22]Romanov VS，Rudolph KL.p21 shapes cancer evolution[J].Nat Cell Biol，2016，18（7）：722-724.

[23]Waga S，Hannon GJ，Beach D，et al.The p21 inhibitor of cyclin-dependent kinases controls DNA replication by" interaction with PCNA[J].Nature，1994，369（6481）：574-578.

[24]Yang D，Yan Y，Hu F，et al.CYP1B1， VEGFA， BCL2， and CDKN1A Affect the Development of Chronic Obstructive" Pulmonary Disease[J].Int J Chron Obstruct Pulmon Dis，2020，15：167-175.

[25]Yang J，Zhang MY，Du YM，et al.Identification and Validation of CDKN1A and HDAC1 as Senescence-Related Hub Genes" in Chronic Obstructive Pulmonary Disease[J].Int J Chron Obstruct Pulmon Dis，2022，17：1811-1825.

[26]Fan J，Chen M，Cao S，et al.Identification of a ferroptosis-related gene pair biomarker with immune infiltration landscapes in ischemic stroke： a bioinformatics-based comprehensive" study[J].BMC Genomics，2022，23（1）：59.

[27]Tarangelo A，Magtanong L，Bieging-Rolett KT，et al.p53 Suppresses Metabolic Stress-Induced Ferroptosis in Cancer Cells[J].Cell Rep，2018，22（3）：569-575.

[28]Chen R，Cao J，Jiang W，et al.Upregulated Expression of CYBRD1 Predicts Poor Prognosis of Patients with Ovarian" Cancer[J].J Oncol，2021，2021：7548406.

[29]Gao XL，Li JQ，Dong YT，et al.Upregulation of microRNA-335-5p reduces inflammatory responses by inhibiting FASN" through the activation of AMPK/ULK1 signaling pathway in a septic mouse model[J].Cytokine，2018，110：466-478.

[30]Zhang Z，Chen L，Xu P，et al.Gene correlation network analysis to identify regulatory factors in sepsis[J].J Transl Med，2020，18（1）：381.

[31]Liang Q，He J，Yang Q，et al.MicroRNA-335-5p alleviates inflammatory response， airway fibrosis， and autophagy in childhood asthma through targeted regulation of autophagy related 5[J].Bioengineered，2022，13（1）：1791-1801.

[32]Sun D，Ma T，Zhang Y，et al.Overexpressed miR-335-5p reduces atherosclerotic vulnerable plaque formation in" acute coronary syndrome[J].J Clin Lab Anal，2021，35（2）：e23608.

[33]Lu W，Ma YY，Shao QQ，et al.ROS/p53/miR-335-5p/Sp1 axis modulates the migration and epithelial to mesenchymal" transition of JEG-3 cells[J].Mol Med Rep，2020，21（3）：1208-1216.

[34]Gu X，Yao X，Liu D.Up-regulation of microRNA-335-5p reduces inflammation via negative regulation of" the TPX2-mediated AKT/GSK3β signaling pathway in a chronic rhinosinusitis mouse" model[J].Cell Signal，2020，70：109596.

[35]Kang Z，Zhu J，Sun N，et al.COL11A1 promotes esophageal squamous cell carcinoma proliferation and metastasis" and is inversely regulated by miR-335-5p[J].Ann Transl Med，2021，9（20）：1577.

[36]Li J，Feng Z，Chen L，et al.MicroRNA-335-5p inhibits osteoblast apoptosis induced by high glucose[J].Mol Med Rep，2016，13（5）：4108-4112.

收稿日期：2023-05-30；修回日期：2023-06-27

編輯/成森