基于網絡藥理學探究脊蛇祛濕膠囊君藥金毛狗脊治療RA的作用機制

摘要：目的 "通過構建“藥物-成分-靶點-疾病”的相互作用網絡，探究脊蛇祛濕膠囊中的君藥金毛狗脊治療類風濕性關節炎（RA）的機制。方法 "通過CNKI和Pubchem數據庫查找金毛狗脊的活性成分并用Swiss Target Prediction數據庫篩選得到的靶點，通過GeneCards和omim數據庫整合篩選得到的靶點，將其取交集得到共同靶點導入Cytoscape行進可視化分析，并通過String和Cytoscape進行蛋白質-蛋白質相互作用網絡分析，運用Metescape數據庫將得到的結果進行GO和KEGG富集分析。結果 "通過Swiss Target Prediction得到金毛狗脊167個藥物靶點，GeneCards和omim數據庫整合篩選RA 3060個靶點，取其交集共91個共同基因，通過String蛋白互作網絡篩選得到20個關鍵基因；GO分析顯示金毛狗脊涉及炎癥反應等生物過程；KEGG分析顯示金毛狗脊參與調節EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性通路、HIF-1信號通路、PI3K-AKT信號通路、雌激素信號通路等。結論 "金毛狗脊的藥效成分與類風濕性關節炎有相同的作用靶點，與其相關的靶點包括ALB、MMP9、EGFR等，金毛狗脊可以通過調節多種通路抑制類風濕性關節炎的進程。

關鍵詞：類風濕性關節炎；金毛狗脊；脊蛇祛濕膠囊

中圖分類號：R259 " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標識碼：A " " " " " " " " " " nbsp; " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2023.13.001

文章編號：1006-1959（2023）13-0001-07

The Mechanism of Action of the Cibotium Barometz of Jishe Qushi Capsule

in the Treatment of RA Based on Network Pharmacology

CEN Cun-hong，HE Ji，ZHI Tai-fa，HUANG Cong，LUO Jin-fang

（Pharmacology Teaching and Research Office of Medicine and Basic Sciences College，Guizhou University of

Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，Guizhou，China）

Abstract：Objective "To explore the mechanism of Cibotium barometz of Jishe Qushi capsule in the treatment of rheumatoid arthritis（RA） by constructing the interaction network of “drug-component-target-disease”.Methods "Through the CNKI and Pubchem database to find the active ingredients of Cibotium barometz， and using the Swiss Target Prediction database to screen the targets， through the GeneCards and omim database integration to screen the targets， the common targets obtained by the intersection were imported into Cytoscape for visual analysis， and the protein-protein interaction network analysis was carried out by String and Cytoscape. The results were analyzed by GO and KEGG enrichment analysis using Metescape database.Results "A total of 167 drug targets were obtained by Swiss Target Prediction， and 3060 RA targets were screened by GeneCards and omim database integration. A total of 91 common genes were intersected， and 20 key genes were screened by String protein interaction network. GO analysis showed that the Cibotium barometz involved biological processes such as inflammatory response. KEGG analysis showed that Cibotium barometz was involved in the regulation of EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance pathway， HIF-1 signaling pathway， PI3K-AKT signaling pathway， estrogen signaling pathway and so on.Conclusion "The active ingredients of Cibotium barometz have the same target as rheumatoid arthritis， the related targets include ALB， MMP9， EGFR， etc. Cibotium barometz can inhibit the process of rheumatoid arthritis by regulating multiple pathways.

Key words：Rheumatoid arthritis;Cibotium barometz;Jishe Qushi capsule

脊蛇祛濕膠囊（Jishe Qushi capsule）是苗藥用于治療RA的一種復方處方藥，由經典藥方金烏健骨方加工而來[1]。方劑中的主要成分為君藥金毛狗脊（Cibotium barometz），臣藥烏梢蛇，兩藤（黑骨藤和雞血藤）再佐以姜黃，白芍和三七活血備用，具有很好的祛風除濕的治療效果[2，3]。君藥金毛狗脊最早記載于《神農本草經》，味苦，甘，性溫，具有補肝腎、強筋骨、舒經絡、除濕痛及利尿等功效，可用來治療多種臨床難癥，是一類較為常見的中藥[4]。類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一類具有較高致殘率且病理表現為滑膜炎與血管翳的慢性自身免疫性疾病[5]。西醫治療主要應用非甾體抗炎藥，糖皮質激素和傳統抗風濕藥等[6]。RA在中醫范疇中屬“痹癥”，苗醫藥中將RA歸屬為“風”類疼痛病。目前占主流的學說中“主藥、輔藥、引藥”與中醫傳統特點的“君臣佐使”遙相呼應。目前，關于脊蛇祛濕膠囊中的君藥成分金毛狗脊治療RA的作用機制尚不清楚，網絡藥理學以大量明確的生物信息數據為基礎，利用多學科的知識及方法[7，8]，分析探索藥物對疾病作用的可能機制。基于此，本研究借助網絡藥理學的方法可對脊蛇祛濕膠囊中的君藥金毛狗脊進行中藥網絡學的研究，構建藥物的“成分-靶點-通路-疾病”網絡，初步探究金毛狗脊治療RA的可能機制和作用靶點，為后續臨床和實驗研究提供更多科學理論依據。

1資料與方法

1.1金毛狗脊藥效成分與靶點篩選 "由于通過TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、TCMID（http：//www.megabionet.org/tcmid/）和BATMAN（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）均未找到金毛狗脊的化學成分，因此通過中國知網檢索金毛狗脊的有效成分和發揮抗風濕作用的活性成分，最終查得金毛狗脊的水溶性成分為原兒茶酸和咖啡酸，具有抗風濕的藥理活性[4，9，10]。在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺數據庫（TCMSP）中以CAS編號作為篩選參照，檢索得到金毛狗脊的化學成分，通過Pubchem獲得金毛狗脊化學成分的化學結構與對應的2D和3D模型。使用Swiss Target Prediction數據庫（http：//swisstargetprediction.ch/）對靶點信息進行收集和處理，剔除重復項后整合，獲取金毛狗脊化合物原兒茶酸和咖啡酸的基因靶點。

1.2檢索RA相關靶點 "使用GeneCards（http：//www.genecards.org/）數據庫和omim數據庫（http：//www.omim.org/）以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞進行檢索，獲得相關疾病作用靶點，并通過uniprot數據庫（http：//www.uniprot.org/）將獲得的靶點轉換為gene name的形式以excel格式導出[11]。

1.3藥物-疾病共同靶點篩選 "在Draw Venn Diagram 在線軟件作圖工具平臺（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/venn/）上分別錄入金毛狗脊和RA的靶點，繪制韋恩圖[12]，得到藥物與疾病的共同靶點并保存。對金毛狗脊有效成分和與“藥物-疾病”共同靶點運用Cytoscape3.9.1軟件進行可視化分析和構建。

1.4蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建及分析 "基于研究金毛狗脊治療RA的靶蛋白之間的相互關系，將藥物-成分-疾病交集靶點基因通過相互作用數據平臺String（https：//string-db.org/）進行相互作用蛋白查詢并構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡，物種設置為“智人”（Homo sapiens），設置最低互動評分（minimum required interaction score）為中等置信度0.400，刪減掉無相互關系的節點[13]，得到金毛狗脊治療RA的蛋白質-蛋白質相互作用網絡。利用Cytoscape3.9.1軟件對PPI網絡進行拓撲分析，其中以介數中間度（betweenness centrality，BC）為主要拓撲參數，篩選出蛋白質-蛋白質相互作用網絡中的關鍵靶蛋白。

1.5基因GO富集分析和KEGG通路分析 "為了明確關鍵靶點蛋白在基因功能及信號通路中的作用，把蛋白質-蛋白質相互作用網絡（PPI）中蛋白關鍵靶點進行GO富集分析和KEGG富集分析。在Metescape（https：//metascape.org）數據庫中輸入經String篩選過刪除重復值的蛋白基因組序列，選擇物種為Homo sapiens[14]。分別勾選KEGG、GOMF、GOCC、GOBP，重復4次分析過程，再將求得的分析結果打包下載。打開維生信（www.bioinformatics.com.cn），將藥物疾病關鍵靶點進行GO分析和KEGG功能富集分析，并將結果以條形圖和氣泡圖形式輸出[15]。

2結果

2.1金毛狗脊藥效成分及靶點的篩選結果 "利用Pubchem平臺和TCMSP數據庫結合CNKI的論文查詢，篩選得到金毛狗脊的抗風濕性有效成分主要包括2個，見圖1；將活性成分對應的SMILES式輸入Swiss Target Prediction數據庫對靶點信息進行集合處理，去除重復值，共篩選出潛在有效成分的167個藥物靶點。

2.2 RA疾病靶點篩選結果 "在GeneCards數據庫和omim數據庫共得到3060個RA疾病靶點。

2.3藥物-疾病共同靶點篩選結果 "在Draw Venn Diagram在線軟件作圖工具平臺上分別錄入金毛狗脊167個藥物靶點與RA相關的3060個靶點，繪制Venny圖，得到兩者的藥物-疾病共同靶點為91個，見圖2。

2.4“藥物-成分-靶點-疾病”的網絡構建及可視化分析 "將金毛狗脊2個潛在抗風濕活性成分與91藥物-疾病共同靶點輸入Cytoscape3.9.1軟件中，繪制并美化“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用的網絡圖（圖3）；圖中下角標代表藥物和疾病的簡寫，六邊形代表金毛狗脊藥物中的2個抗風濕作用的潛在化學成分。左側為原兒茶酸（protocatechuic acid）的46個活性成分靶點，右側為咖啡酸（Caffeic acid）的30個活性成分靶點（其中有124個活性成分靶點與疾病靶點無交集，予以刪除），外側大圓為91個疾病靶點。

2.5 靶蛋白質-蛋白質相互作用網絡分析 "在String數據庫中錄入“藥物-疾病”的91個共同靶點，MRIS設置成中等置信度0.400，分析得到蛋白相互作用網絡圖（圖4），共有91個相互作用的節點，682條相互作用連線，平均節點讀值為15，平均集聚系數為0.601。通過Cytoscape3.9.1軟件中的CytoNCA工具分析篩選選擇BC值為主要拓撲參數，分析篩選得到了20個關鍵靶點基因，見圖5、表1。

2.6 GO富集分析 "將金毛狗脊治療RA的91個靶基因輸入Metescape數據庫進行GO富集分析，結果顯示，交集基因集合共富集至1187條BP通路，主要有對細胞激素的反應（Response to cytohormones）、對激素刺激的反應（Response to hormonal stimulation）、對類固醇激素的反應（Response to steroid hormones）、細胞內受體信號通路（Intracellular receptor signaling pathway）、細胞對有機環狀化合物的反應（Cellular response to organic ring compounds）、激素介導的信號通路（Hormone-mediated signaling pathway）、細胞對類固醇激素刺激的反應（Cellular response to steroid hormone stimulation）、類固醇激素介導的信號通路（Steroid hormone-mediated signaling pathway）、蛋白質磷酸化（Phosphorylation of protein）、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路等80條；CC通路表明起抗RA的場所主要存在于膜筏、膜微區、小窩、粘著斑痕、細胞-基質連接、質膜筏、受體復合物、早期內體、細胞基膜等；交集基因集合共富集123個與MF相關的過程中，主要涉及包括蛋白酪氨酸激酶活性（Protein tyrosine kinase activity）、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（Protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）、蛋白激酶活性（Protein kinase activity）、磷酸轉移酶活性、醇基作為受體（Phosphotransferase activity，alcohol group as acceptor）、激酶活性（Kinase activity）、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（Protein serine/threonine kinase activity）、蛋白質絲氨酸激酶活性（Protein serine kinase activity）、核受體活性（Nuclear receptor activity）、配體激活轉錄因子活性（Ligand activates transcription factor activity）、核類固醇受體活性（Nuclear steroid receptor activity）等，分別將他們篩選前10個條目進行條形圖可視化，見圖6。

2.7 KEGG通路富集分析 "將金毛狗脊治療RA的91個靶基因輸入Metescape數據庫進行KEGG分析后共得到156條KEGG通路，結果顯示共同靶點主要富集于PI3K-Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、HIF-1信號通路、雌激素信號通路、Rap1信號通路、Ras信號通路等，其作用機制主要與癌癥治療、激素控制有關。選取前20條結果形成KEGG通路富集的條形圖和氣泡圖，見圖7、圖8。

3討論

本研究基于網絡藥理學的方法，篩選出金毛狗脊的2個主要活性成分，167個藥物靶點，3060個疾病靶點，取其活性成分和抗RA疾病靶點交集91個，構建“靶點-成分-疾病”可視化網絡。目前，藥物已知的主要活性成分有原兒茶酸和咖啡酸[16，17]。核心靶點有ALK、SERPINE1、ALB、TYR、FYN、LCK、MMP8、ESR1、PARP1等，其中證實以脂多糖（LPS）[18]刺激單核巨噬細胞RAW647.7及炎性介質（NO）和前列腺素（PEG2）的水平可以用來評價金毛狗脊的抗炎作用水平，原兒茶酸能抑制MMI+的表達來實現廣泛抗炎作用[19]。

從PPI網絡成分圖分析可知藥物活性的主要成分基因。ALB編碼人體血液中最豐富的蛋白質，這種蛋白質在調節血漿膠體滲透壓中起作用，并作為各種內源性分子（包括激素，脂肪酸和代謝物）以及外源性藥物的載體蛋白。此外，這種蛋白質表現出酯酶樣活性，具有廣泛的底物特異性。編碼的前蛋白經過蛋白水解處理以產生成熟蛋白質，衍生自該蛋白的肽EPI-X4是CXCR4趨化因子受體的內源性抑制劑。EGFR基因編碼的蛋白質是跨膜糖蛋白，是蛋白激酶超家族的成員，這種蛋白質是表皮生長因子家族成員的受體。EGFR是一種細胞表面蛋白，與表皮生長因子結合，從而誘導受體二聚化和酪氨酸自磷酸化，導致細胞增殖。金毛狗脊可能就是通過這91個共同白蛋基因發揮抑制RA炎癥，調節免疫平衡的作用。

從KEGG 和GO富集分析圖可知，得到這些靶點的生物過程包括炎癥反應、T細胞活化、對前列腺素等類固醇激素的反應、參與PI3K-AKT信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、HIF-1信號通路、雌激素信號通路、Rap1信號通路、Ras信號通路調節以及細胞因子與受體之間的相互作用。有研究證明[20]，咖啡酸乙酯可能通過抑制MAPK信號通路（p-38和ERK1/2）磷酸化，從而干擾IFN-/STAT1-/IFN-信號途徑下調轉錄因子和STAT1的表達，從而產生抗炎活性。咖啡酸類化合物發揮抗炎作用主要通過抑制下游被激活的MAPK/NF-κB信號通路，當LPS與巨噬細胞表面受體結合，激活了下游的MAPK/NF-κB信號通路后，KC-I化合物可以通過抑制MAPK/NF-κB通路中的一些蛋白表達來減輕炎癥癥狀，從而起到抗炎作用[21]。本文網絡藥理學推測的結果與以上研究均一致，說明網絡藥理學的方法推測金毛狗脊作用靶點和通路是有一定科學性和可行性的。

目前對RA的發病機制尚不明確，而中醫藥的使用可以減輕或規避西醫用藥導致的副作用及用藥單一的問題。通過對中藥金毛狗脊的研究，運用現代網絡藥理學的方法建立“藥物-成分-靶點-疾病”的網絡關系，可以找到君藥金毛狗脊與RA關鍵靶點的交集和可能作用通路，為含有金毛狗脊的中藥處方的運用和研究提供進一步的科學參考依據。

綜上所述，本研究共搜集到金毛狗脊 2種活性成分及相關的 58 個潛在靶點，RA 疾病相關的167 靶點，其中金毛狗脊-RA交集靶點91個，發現金毛狗脊可能是通過調節 ALK、SERPINE1、ALB、TYR、FYN、LCK、MMP8、ESR1、PARP1等靶點，調控癌癥相關通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性通路、HIF-1信號通路、雌激素信號通路、Rap1信號通路等，發揮抑制炎癥反應、調節免疫功能及調控細胞凋亡等作用來治療RA。但因目前各平臺數據庫數據更新程度不同，相應分析方法有所區別，得出的結果僅可作為實驗研究的理論參考，其作用機制還有待后續進一步的實驗進行藥物作用靶點和機制的驗證。

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收稿日期：2023-04-26；修回日期：2023-05-07

編輯/成森