胃癌組織中circMAPK14的表達及意義研究

唐 潔,宋 丹

(重慶市大渡口區人民醫院急診科,重慶 400084)

胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤之一,在全球的發病率和致死率均較高。盡管醫學的進步促進了胃癌的診斷和治療,但大多數晚期胃癌患者的5年總生存率仍不到30%[1]。目前,臨床上胃癌的治療方式主要為外科手術(早期或中期)和化、放療(晚期)。早期手術效果較好,生存率可超過90%,而晚期常常面臨患者對放化療不敏感或者耐受性較差的問題,且患者容易復發,因此迫切需要尋找新的治療方式[2]。環狀RNAs(circular RNAs,circRNAs)是一類以共價鍵形成閉合環狀結構的長鏈非編碼RNA,沒有5′帽子結構和3′ poly A尾巴,具有穩定性、豐富性和保守性等特點[3-4]。研究表明,circRNA在消化系統惡性腫瘤的發生和發展中發揮重要作用[5-7]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路是眾多經典信號轉導通路之一,通過蛋白激酶、轉錄因子等信號將細胞外信號轉運至細胞內,最終導致細胞增殖、分化、凋亡、轉移等[8]。MAPK14是MAPK家族的關鍵成員,在信號級聯中發揮核心功能[9]。然而,源自MAPK14的circRNA(circMAPK14)在胃癌中是否具有功能,目前缺乏相關報道。本研究分析胃癌患者癌灶組織及癌旁組織中circMAPK14(hsa_circ_24603)的表達情況,研究其功能和相關機制,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床組織標本

收集2021年2月至2022年8月本院收治的29例胃癌患者癌灶組織和癌旁組織(距離腫瘤組織邊緣2 cm)作為研究對象。患者和家屬均簽署了知情同意書。

1.1.2細胞株及試劑

正常永生化胃上皮細胞株GES-1和人胃癌細胞系SGC7901購于美國典型培養物保藏中心(ATCC)細胞庫;DMEM高糖培養基、RPMIl640培養基、Opti-MEM培養基、胎牛血清、胰酶購于美國HyClone公司;細胞計數試劑盒(CCK-8)購于日本Dojindo Laboraories公司;LipofectamineTM2000轉染試劑購于美國Invitrogen公司;逆轉錄試劑盒、TRIzol試劑購于TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司;SYBR Green/ROX Master Mix試劑盒購于加拿大Fermentas公司;膜聯蛋白-Ⅴ(Annexin-Ⅴ)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡檢測試劑盒、叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide,TBH)購于德國Sigma公司;抗體p-MAPK14、β-actin、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的二抗購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1臨床組織標本處理

將收集的組織標本在液氮中速凍,用研缽研磨后加入TRIzol試劑提取RNA,再逆轉錄為cDNA。

1.2.2細胞培養

SGC7901用RPMIl-1640培養基、GES-1用DMEM高糖培養基培養,胎牛血清濃度為10%。培養箱設定參數為37 ℃、5% CO2、飽和濕度。

1.2.3小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)干擾與TBH處理

circMAPK14 siRNA干擾序列由廣州銳博生物技術有限公司設計合成,分裝、儲存方法按照說明書進行。將對數生長期的SGC7901細胞用胰蛋白酶消化計數后接種于6孔板(每孔約5×105個細胞),待細胞密度約為60%時,更換成無血清培養基。24 h后進行轉染,實驗組加入終濃度50 nmol/L的circMAPK14 siRNA,對照組加入同劑量的陰性對照(scramble siRNA),轉染48 h。

1.2.4流式細胞分析

實驗組與對照組均加入TBH(分別納入實驗+TBH組,對照+TBH組),濃度為50 μmol/L。24 h后收集細胞及上清液,用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次,室溫1 000 r/min離心5 min,按照Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行處理,流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。

1.2.5逆轉錄實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測

根據不同標本的cDNA,檢測circMAPK14、MAPK14、Noxa、Bax、Puma的表達水平。以GAPDH基因為內參基因,采用SYBR Green/ROX Master Mix試劑盒通過熒光定量PCR儀(美國BioRad公司)進行操作,引物序列見表1。提取SGC7901、GES-1細胞RNA,逆轉錄后定量檢測circMAPK14的表達情況。

表1 PCR引物序列

1.2.6CCK-8法檢測細胞增殖

將SGC7901細胞接種于96孔板中,每孔1×103個細胞,12 h后更換成無血清培養基進行siRNA干擾。轉染24、48 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑,在細胞培養箱中孵育1 h后用酶標儀檢測450 nm處吸光度[A(450)]值。每組實驗重復3次,取平均值并繪制生長曲線圖。

1.2.7劃痕試驗

將SGC7901細胞接種于6孔板中(1×106/孔),轉染24 h后用無菌200 μL移液器槍頭沿孔的中間刮擦細胞板,顯微鏡拍照。隨后更換成無血清培養基,孵育48 h后再用顯微鏡拍照。

1.2.8Western blot檢測MAPK14磷酸化水平

干擾circMAPK14 48 h后,棄掉細胞上清液,預冷的PBS洗滌2次,加入蛋白裂解液冰上裂解30 min,刮下細胞后置于1.5 mL EP管中,12 000 r/min、4 ℃離心15 min。轉移裂解上清液并檢測蛋白水平。在裂解液中加入5×上樣緩沖液,煮沸5 min。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(12%)后將分離的蛋白條帶轉移到硝酸纖維膜上,麗春紅染色、漂洗后用5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h,加入一抗孵育,4 ℃過夜。吸掉一抗后加入TBST洗膜3次,再用二抗室溫孵育2 h,吸棄二抗洗膜后進行化學發光反應,使用ImageJ進行灰度值分析。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 circMAPK14在癌灶組織和胃癌細胞中的表達

納入研究的29例胃癌患者癌灶組織中circMAPK14的mRNA表達水平低于癌旁組織(P<0.01);SGC7901細胞中circMAPK14的mRNA表達水平低于GES-1細胞(P<0.01),見圖1。

A:circMAPK14在癌灶組織中和癌旁組織中的表達水平;B:circMAPK14在SGC7901和GES-1細胞中的表達水平;a:P<0.01。

2.2 對照組與實驗組胃癌細胞circMAPK14 mRNA表達水平比較

實驗組circMAPK14的mRNA表達水平低于對照組(P<0.01),見圖2。

a:P<0.01。

2.3 circMAPK14對細胞增殖的影響

CCK-8結果顯示,實驗組吸光度明顯高于對照組(P<0.01),細胞增殖明顯增強,見圖3。

a:P<0.01,與對照組比較。

2.4 circMAPK14對胃癌細胞凋亡的影響

流式細胞術結果顯示,實驗+TBH組細胞凋亡率低于對照+TBH組(P<0.01),下調SGC7901細胞circMAPK14表達會降低由TBH誘導的SGC7901細胞凋亡,見圖4。

A:流式細胞圖;B:統計分析圖;①:對照組;②:實驗組;③:對照+TBH組;④:實驗+TBH組;a:P<0.01。

2.5 circMAPK14對胃癌細胞的遷移影響

劃痕實驗結果表明,實驗組細胞遷徙能力明顯上升,見圖5。

圖5 劃痕實驗檢測circMAPK14對SGC7901細胞遷移的影響(200×)

2.6 circMAPK14對MAPK14和凋亡相關基因的影響

實驗組MAPK14磷酸化水平增強,Bax、Puma、Noxa的mRNA表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.01),見圖6。

A、B:p-MAPK14的Western blot實驗結果;C:凋亡相關基因mRNA表達水平比較;a:P<0.01。

3 討 論

胃癌是常見的惡性腫瘤之一,靶向治療方法正越來越受到重視。最初,研究人員認為circRNA是機體錯誤拼接的產物,不具有任何生物學作用,但隨著人們對基因研究的深入,發現circRNA具有強大的功能,與細胞分化、細胞存活、細胞增殖息息相關,在胃癌的治療方面發揮重要作用。例如circRNA GAP1能競爭結合miR-877-3p的靶位點,抑制其表達,從而促進胃癌細胞的侵襲、遷移和生長[10]。核受體相互作用蛋白1環狀RNA(circNRIP1)充當miR-149-5p的海綿,活化下游的AKT1/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路,促進胃癌細胞進展和上皮-間充質轉化[11]。YANG等[12]的體內體外實驗均證明人抗原R環狀RNA(circHuR)能抑制胃癌細胞的生長。線粒體核糖體蛋白S35環狀RNA(circMRPS35)可作為分子支架,將組蛋白乙酰轉移酶KAT7募集到叉頭轉錄因子O亞型1(FOXO1)和叉頭轉錄因子O亞型3a(FOXO3a)基因的啟動子上,從而誘導H4K5的乙酰化,觸發FOXO信號通路,抑制胃癌細胞的侵襲和增殖[13]。氧固醇結合蛋白樣10抗體環狀RNA(circOSBPL10)可作為胃癌患者總生存期和無病生存期的一個預后指標[14]。此外,還有研究指出,circRNA參與了胃癌化療耐藥的調控[15-16]。因此,circRNA具有潛在治療靶點、生物學標志物等優勢。

MAPK信號通路參與調控了細胞增殖、遷移、分化和凋亡等一系列生理活動[8,17]。MAPK共有4個亞族:細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)1/2、ERK5、p38、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)[17]。p38的活化不僅能促進腫瘤細胞的增殖、轉移和侵襲,還能通過調控血管的形成來促進腫瘤細胞在人體的發展[18-20]。此外,某些藥物也能通過抑制p38通路來發揮效果,例如異丙酚通過抑制表皮生長因子受體和p38的表達來抑制細胞增殖與侵襲,二氫楊梅素通過抑制ERK和p38的表達而具有明顯抑制胃癌細胞增殖的效能[21-22]。MAPK14即p38α,屬于p38成員之一,可通過激活多種轉錄因子產生級聯反應,發揮其生物學效應[9]。自發現MAPK14以來,臨床試驗闡明了其在腫瘤發生、轉移、侵襲和化療反應中的作用[23-24]。因此,在胃癌中尋找與MAPK14緊密相關的circRNA至關重要。

本研究中的circRNA來源于MAPK14,是在胃癌組織中發現的差異表達明顯的基因,提示此circRNA可能與胃癌的發生、發展有關。進一步研究發現,circMAPK14能抑制胃癌細胞增殖、遷移,促進細胞凋亡,這為胃癌的研究提供了新思路和可能的治療靶點。機制研究方面,本研究結果提示circMAPK14可作為MAPK信號通路的調控因子,調控MAPK14磷酸化水平,并產生級聯效應,影響Bax、Noxa、Puma等抑癌基因的表達,從而抑制胃癌細胞的增殖、凋亡等進程。

然而,circRNA對MAPK的調控方式多種多樣,部分通過充當miRNAs的分子海綿,進而調控MAPK和PI3K/AKT-mTOR信號通路[25];部分circRNA能編碼蛋白,影響MAPK磷酸化進而影響癌癥的進程[26];部分扮演支架角色影響相關基因的降解,從而調控MAPK信號通路[27]。本研究已明確circMAPK14能影響MAPK14的磷酸化,但如何調控還需更深入的實驗研究。