自噬調控對小鼠精原細胞缺氧/復氧損傷的影響研究*

胡 志,付 橋,張 煒,孫 偉,徐 律,陳一衍,褚 浩

(武漢市第三醫院泌尿外科,武漢 430000)

睪丸缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)被認為是睪丸扭轉和退扭的潛在機制,睪丸缺血因為有氧代謝受損會導致炎癥細胞因子的產生和細胞死亡,睪丸再灌注后由于活性氧(ROS)的產生和局部毛細血管功能障礙,組織進一步損傷,誘導DNA損傷,使精子發生永久性損傷[1-2]。但目前臨床上還沒有緩解睪丸IRI的有效藥物。

研究發現,自噬在多種組織器官的IRI過程中具有保護作用,自噬受損會增加再灌注期間細胞的損傷[3]。自噬是溶酶體分解代謝過程,能消除老化的細胞器和大分子蛋白,為細胞器更新和細胞修復提供原料和營養[4]。自噬受缺氧、滲透性和活性氧等因素影響,在維持細胞穩態中起關鍵作用[5]。自噬是IRI的關鍵調節因子,不僅可用于抑制大鼠腎小管凋亡和減輕腎IRI期間的腎功能損害,還具有神經保護作用,能夠減輕心肌IRI[6-7]。在適度范圍內增強自噬活性也許能補償線粒體損傷,并有助于IRI中的蛋白平衡,恢復受損的自噬通量可能是緩解IRI的有效途徑[8]。因此,為了探究自噬在睪丸組織的IRI過程中扮演的角色,本研究構建小鼠精原細胞缺氧/復氧損傷(hypoxia reoxygenation injury,H/RI)模型,模擬睪丸組織的IRI階段,從多方面觀察自噬對大鼠睪丸組織IRI的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠精原細胞GC-1 spg購自賽百慷(上海)生物技術股份有限公司,胰蛋白酶、噻唑藍(MTT)、dNTP Mix和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司,自噬激動劑RAPA和自噬抑制劑3-MA購自美國MCE公司,活性氧檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司,硫氰酸熒光素標記的鈣離子依賴磷脂結合蛋白/碘化丙啶(AnnexinⅤ-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司,兔抗LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1、p62、Bcl-2、Bax和GAPDH購自武漢貝茵萊生物科技,兔抗caspase-3購自德國CST公司。

1.2 儀器

311型CO2恒溫培養箱購自美國Thermo公司,DMIL LED倒置熒光顯微鏡購自德國Leica公司,Forma-8000三氣培養箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司,AMR-100酶標儀、Nano-300超微量分光光度計購自杭州奧盛儀器有限公司,NovoCyte流式細胞儀購自美國Acea公司,Tanon-5200全自動化學發光分析儀購自上海天能生命科學有限公司,GE48527型PCR儀購自杭州柏恒科技有限公司,CFX-Connect 96熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1細胞培養與傳代

將融化后的細胞懸液400×g離心3 min,棄上清液后重懸,在37 ℃、5% CO2的培養箱內培養。倒置顯微鏡下觀察細胞形態。打開T25培養瓶,瓶口過火,丟棄培養瓶內的培養液,用PBS洗去殘留。培養瓶加入0.25%胰酶,37 ℃消化,用倒置顯微鏡進行觀察,細胞收回突起變圓時立即翻轉培養瓶,倒掉與細胞脫離的胰酶,加入培養基潤洗,使細胞脫壁并分散,制成細胞懸液,分裝。

1.3.2細胞模型構建

將完成傳代的細胞分為4組:對照組、模型組、自噬激動劑干預組和自噬抑制劑干預組。收集細胞,調整細胞懸液濃度為5×105/孔。對照組細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱中正常培養24 h。模型組細胞按照文獻[9],用預先缺氧的無血清培養基在5% CO2、1% O2和94% N2的三氣培養箱培養24 h,構建H/RI模型。自噬激動劑干預組在模型構建成功后,將細胞移至常氧培養箱復氧2 h后,添加50 nmol/L的自噬激動劑RAPA常規孵育12 h。自噬抑制劑干預組在細胞復氧2 h后,添加5 mmol/L的自噬抑制劑3-MA常規孵育12 h。

1.3.3MTT檢測各組細胞增殖活力

調整細胞懸液濃度為3×103/孔,在37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜,使細胞貼壁。按照1.3.2不同分組處理細胞,培養24 h后加入10 μL MTT 溶液(5 mg/mL),繼續培養4 h。然后棄去上清液,加入二甲基亞砜(DMSO)溶解液充分溶解結晶物。用分光光度計測量各孔的吸光度(A)值。

1.3.4流式細胞術檢測各組細胞ROS水平

收集各組細胞懸浮于10 μmol/L的活性氧熒光探針(DCFH-DA)中,濃度為1×106/mL,37 ℃、5% CO2細胞培養箱內孵育20 min。DCFH-DA和細胞充分接觸后,用無血清細胞培養液洗滌細胞3次,去除未進入細胞內的DCFH-DA。用PBS重懸細胞,用流式細胞儀檢測ROS。

1.3.5流式細胞術檢測各組細胞凋亡水平

收集各組細胞,重懸使細胞濃度為1×106/孔,400×g離心5 min,棄上清液,重懸于200 μL PBS。加入10 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI,4 ℃避光孵育30 min;加入300 μL PBS,進行流式檢測。

1.3.6實時熒光定量PCR(qPCR)檢測細胞中自噬和凋亡相關基因表達水平

取細胞約1×106個,加1 mL TRIzol提取總RNA。逆轉錄合成cDNA。將合成的cDNA進行PCR擴增。PCR反應條件為:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性5 s,56 ℃退火10 s,72 ℃延伸25 s,共40個循環。其中GAPDH作為內參進行樣品間的校正,使用2-ΔΔCt法計算各基因mRNA表達水平,各目標基因引物見表1。

表1 引物序列

1.3.7Western blot法檢測自噬和凋亡相關蛋白表達水平

取各組細胞加入細胞裂解液,用蛋白提取試劑盒提取總蛋白,并用BCA法檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。4 ℃封閉過夜,分別加入兔抗Beclin1、Bax、caspase-3、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62、Bcl-2和GAPDH單克隆抗體(1∶1 000),室溫孵育1 h。加入二抗,室溫孵育1 h。洗膜后加入化學發光試劑顯色,讀取條帶灰度值。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 MTT法檢測各組細胞增殖能力

與對照組比較,模型組小鼠精原細胞增殖能力明顯下降(P<0.01),自噬激動劑干預組小鼠精原細胞增殖能力較模型組明顯提高(P<0.01),自噬抑制劑干預組小鼠精原細胞增殖能力較模型組明顯降低(P<0.01),見圖1。

1:對照組;2:模型組;3:自噬激動劑干預組;4:自噬抑制劑干預組;a:P<0.01,與對照組比較;b:P<0.01,與模型組比較。

2.2 流式細胞術檢測各組細胞ROS水平

與對照組比較,模型組小鼠精原細胞ROS水平明顯升高(P<0.01);與模型組比較,自噬激動劑干預組小鼠精原細胞ROS水平明顯降低(P<0.01),自噬抑制劑干預組小鼠精原細胞ROS水平明顯升高(P<0.01),見圖2。

A:流式細胞圖;B:定量分析圖;1:對照組;2:模型組;3:自噬激動劑干預組;4:自噬抑制劑干預組;a:P<0.01,與對照組比較;b:P<0.01,與模型組比較。

2.3 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率

與對照組比較,H/RI模型組細胞凋亡率明顯增加(P<0.01);與模型組比較,自噬激動劑干預組的細胞凋亡率明顯降低(P<0.01),而自噬抑制劑干預組細胞凋亡率則明顯升高(P<0.01),見圖3。

A:流式細胞圖;B:定量分析圖;1:對照組;2:模型組;3:自噬激動劑干預組;4:自噬抑制劑干預組;a:P<0.01,與對照組比較;b:P<0.01,與模型組比較。

2.4 qPCR檢測各組細胞中Beclin1、Bax、Bcl-2的mRNA表達水平

與對照組比較,模型組小鼠精原細胞中Beclin1和Bcl-2 mRNA表達水平明顯下降,Bax mRNA表達水平明顯上升(均P<0.01);與模型組比較,自噬激動劑干預組小鼠精原細胞中Beclin1和Bcl-2 mRNA表達水平明顯上升(P<0.01),Bax mRNA表達水平明顯下降(P<0.01);與模型組比較,自噬抑制劑干預組小鼠精原細胞中Beclin1和Bcl-2 mRNA表達水平明顯下降(P<0.01),Bax mRNA表達水平明顯升高(P<0.01),見圖4。

a:P<0.01,與對照組比較;b:P<0.01,與模型組比較。

2.5 Western blot檢測各組細胞自噬相關蛋白和凋亡相關蛋白的表達水平

與對照組比較,模型組小鼠精原細胞Beclin1、Bax、caspase-3表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值水平明顯上升(P<0.01),p62和Bcl-2蛋白表達水平明顯下降(P<0.01);與模型組比較,自噬激動劑干預組小鼠精原細胞Beclin1、Bcl-2蛋白表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值均明顯上升(P<0.01),p62、Bax和caspase-3蛋白表達水平明顯下降(P<0.01);與模型組比較,自噬抑制劑干預組Beclin1、Bcl-2蛋白表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值均明顯下降(P<0.01),p62、Bax、caspase-3蛋白表達水平明顯上升(均P<0.01),見圖5。

A:Western blot圖;B:定量分析圖;1:對照組;2:模型組;3:自噬激動劑干預組;4:自噬抑制劑干預組;a:P<0.01,與對照組比較;b:P<0.01,與模型組比較。

3 討 論

自噬是細胞存活的重要機制,在細胞分化、發育、穩態、細胞存活和死亡中發揮著重要作用[10]。自噬在哺乳動物組織中發揮著多種生理和病理作用[11]。在生理條件下,自噬維持在基礎水平,但當細胞受到營養缺乏、缺氧DNA損傷、細胞毒性劑等刺激時,細胞自噬會上調以減輕應激引起的損傷,幫助細胞生存[8]。而本研究中模型組細胞自噬在一定程度上被激活,進一步為自噬減輕缺氧造成的損傷提供了理論支持。因此,本文利用公認的自噬激動劑RAPA[12]和抑制劑3-MA[13],對自噬與睪丸組織IRI之間的關系進行了深入研究。RAPA能夠抑制雷帕霉素靶蛋白的表達,激活自噬[14]。3-MA通過阻斷自噬體形成和阻止成核階段來抑制自噬[15]。本研究中H/RI模型組細胞自噬過程被激活時,細胞增殖能力較模型組明顯上升,而自噬被抑制時,增殖能力較模型組下降,說明調節細胞自噬能夠影響H/RI模型細胞增殖,這與之前的研究一致[16]。

研究表明,自噬的激活能改善年輕大鼠的腎功能,減少腎小管上皮細胞的凋亡和腎組織的損傷評分,對腎IRI損傷發揮保護作用[17]。本研究中,自噬在RAPA的激活下,細胞內LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值、Beclin1蛋白水平較模型組升高,p62水平較模型組下降。LC3是自噬小體成熟標志蛋白,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉變,促進自噬體的形成[18]。Beclin1作為自噬調控基因,其表達水平增加能夠誘導自噬的發生。p62作為自噬降解的特異性受體,可作為自噬標志物[19]。而自噬在3-MA的抑制下,Beclin1蛋白水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值較模型組下降,進而抑制自噬體的形成。且當自噬被抑制時,p62會不斷累積,與LC3結合形成復合物,負性調節自噬活性[20]。

本研究中,在RAPA干預下,自噬被激活,抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平較模型組明顯上升,caspase-3和促凋亡蛋白Bax表達水平較模型組下降。這減少了因為缺血導致Bax向線粒體外膜易位,抑制了線粒體外膜通透性增加觸發的內源性凋亡途徑,從而抑制了caspase-3級聯反應,使細胞凋亡率明顯下降[21]。該結果證明了增強自噬可以避免因ROS過度釋放導致的細胞凋亡[22],修復精原細胞組織H/RI損傷。

此外,激活自噬可清除過量ROS,減輕睪丸組織H/RI[23]。IRI后ROS的大量積累會導致氧化應激,阻礙線粒體功能,破壞細胞穩態環境,損害自噬小體的清除[24-25]。本研究中,RAPA干預時,細胞ROS水平較模型組明顯降低,細胞凋亡率較模型組明顯下降;而3-MA干預時,ROS在細胞內大量積累,細胞凋亡率較模型組明顯上升。

綜上所述,本研究驗證了增強自噬可以一定程度上修復小鼠精原細胞H/RI,抑制細胞凋亡,為治療睪丸組織IRI提供理論基礎。