旱作果園土壤促生菌的篩選與鑒定

王琦 王媛媛 李陽 李夏媛 田鑫 武艷霞 史高川

收稿日期：2023-07-20中文收稿日期

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD1901105）；山西省科技重大專項(xiàng)計(jì)劃“揭榜掛帥”（202101140601026）；山西省基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（202203021212445）；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士人才引進(jìn)科研啟動項(xiàng)目（2022BQ15）；山西省博士畢業(yè)生、博士后研究人員來晉工作獎(jiǎng)勵(lì)經(jīng)費(fèi)科研項(xiàng)目（SKBYKY2022085）。

第一作者簡介：王? 琦（1990-），女，助理研究員，主要從事果園地力提升及微生物群落結(jié)構(gòu)研究工作。電話：13070126381；E-mail：wq210509@sxau.edu.cn

*通信作者：史高川（1976-），男，副研究員，主要從事梨果栽培及有害生物防控的研究。

摘? 要：【目的】為促進(jìn)旱作果園有機(jī)培肥過程中土壤養(yǎng)分高效利用。【方法】通過實(shí)驗(yàn)室平板培養(yǎng)和高通量測序等方法，對有機(jī)果園根際土壤微生物進(jìn)行篩選。【結(jié)果】結(jié)果表明，果園土壤微生物的最適篩選濃度為10-2和10-3，在所得菌株中經(jīng)鑒定，熱羧基鏈霉菌和枯草芽孢桿菌這兩株同時(shí)具有纖維素分解、固氮、解磷和解鉀等功能。【結(jié)論】熱羧基鏈霉菌和枯草芽孢桿菌能激發(fā)旱作果園的培肥效果。

關(guān)鍵詞：菌劑；培肥；果園；有機(jī)旱作；土壤養(yǎng)分

文章編號：2096-8108（2023）06-0034-04? 中圖分類號：S606+.1中圖分類號? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文獻(xiàn)標(biāo)志碼

Screening and Identification the Growth-promoting Bacteria in Upland Orchard Soil

WANG? Qi1，WANG? Yuanyuan2，LI? Yang1，LI? Xiayuan1，TIAN? Xin1，WU? Yanxia1，SHI? Gaochuan1*

（1.Pomology Institute， Shanxi Agricultural University， Taiyuan Shanxi 030031，China;

2.Shennong Seed Industry（Shanxi）Co.， Ltd，Taiyuan Shanxi 030012，China）

Abstract：【Objective】 To promote the efficient utilization of soil nutrients in the process of organic fertilization in dry orchards. 【Methods】 The soil microorganisms in the rhizosphere of organic orchards were screened by laboratory plate culture and high-throughput sequencing. 【Results】 The results showed that the optimal screening concentrations of soil microorganisms in orchards were 10-2 and 10-3， and the two strains of Streptomyces thermocarboxydusand Bacillus subtilis were identified as having the functions of cellulose decomposition， nitrogen fixation， phosphorus and potassium removal. 【Conclusion】Streptomyces thermocarboxydus and Bacillus subtilis can stimulate the fertilization effect of dry orchards.

Keywords：fungicide; fertilizer; orchard; organic dry farming; soil nutrient

在干旱條件下，長期施用化肥造成果園土壤質(zhì)量變差、肥力降低，有益微生物多樣性低、群落結(jié)構(gòu)差，直接導(dǎo)致果樹產(chǎn)量低、果品品質(zhì)差，制約著果園的可持續(xù)發(fā)展。隨著人們環(huán)保意識和對綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的重視，有益微生物特別是植物促生菌（plant growth-promoting bacteria，PGPB）的應(yīng)用被認(rèn)為是提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)率、改善土壤及環(huán)境健康的有效措施［1］。然而，在山西干旱的背景下，通過添加植物促生菌改善有機(jī)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中土壤養(yǎng)分循環(huán)利用、果樹養(yǎng)分高效利用的研究缺乏系統(tǒng)性。基于此，本文對果園促生菌種的篩選與鑒定展開研究。

植物促生菌可通過固氮、解磷解鉀等直接或間接促進(jìn)植物生長及發(fā)育，從而抵御植物受到干旱脅迫而引發(fā)的生長限制［2-3］。此外，促生菌還可改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而促進(jìn)植物的生長發(fā)育［4-5］。有研究表明，熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）可通過固氮作用，促進(jìn)小麥［6］（Triticum aestivum）等作物的生長發(fā)育。此外，接種嗜根鏈霉菌（Streptomyces rhizophilus）、球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）和解淀粉芽孢桿菌后，通過氨化作用促進(jìn)土壤中有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為無機(jī)氮，從而提高油菜（Brassica napus）中總氮含量［7］。同樣的，膠質(zhì)芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌則能促進(jìn)蔬菜等對鉀的吸收利用，在提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的同時(shí)，緩解了植物所受鹽漬化的脅迫［8］。因此，篩選土壤中的植物促生菌能夠有效增加植物對養(yǎng)分的利用效率，改善有機(jī)培肥果園中土壤養(yǎng)分供需不匹配的狀況。

鑒于此，本研究從果樹根際促生菌入手，通過篩選山西旱區(qū)有機(jī)培肥果園中具有促生功能的微生物，然后對其不同促生功能進(jìn)行測定與驗(yàn)證，同時(shí)對不同菌株的形態(tài)和分子學(xué)水平進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步研制旱作果園田間促生菌劑提供微生物材料。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用土壤樣品采集于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所核桃園、梨園和櫻桃園中，共計(jì)5個(gè)土壤樣品，其中有機(jī)培肥果園3個(gè)，分別為核桃園（SM1）、梨園（SM2）和櫻桃園（SM3）；常規(guī)施肥果園2個(gè)，分別為核桃園（EM1）、梨園（EM2）。供試土壤于2022年5月20日采集于不同果園，土壤采集后立即裝入自封袋，液氮保存并迅速轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，保存于-30℃冰箱用于后續(xù)微生物分離。

1.2? 試驗(yàn)方法

分別采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基和高氏Ⅰ號培養(yǎng)基對土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌進(jìn)行微生物最佳濃度確定及篩選。然后利用纖維素分解培養(yǎng)基對纖維素分解菌進(jìn)行分離、純化，并通過阿須貝無氮培養(yǎng)基、亞歷山大硅酸鹽培養(yǎng)基、NBRIP（溶解無機(jī)磷）和NBRIPY（溶解有機(jī)磷）培養(yǎng)基對分離所得菌株的養(yǎng)分活化能力進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證［9］。并通過高通量測序?qū)δ繕?biāo)菌株進(jìn)行菌種鑒定（委托上海派森諾生物科技有限公司測定），并利用顯微鏡對菌落結(jié)構(gòu)進(jìn)行鏡檢。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計(jì)分離使用Excel 2019和Minitab 18.0進(jìn)行分析處理。纖維素分解能力（R）等于菌落透明圈直徑（D，cm）除以菌落直徑（d，cm），

即R=Dd。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 土壤微生物最佳篩選濃度

通過對不同果園土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌的培養(yǎng)最佳土壤浸提液稀釋濃度篩選發(fā)現(xiàn)（見表1），施用有機(jī)肥之后，土壤微生物豐富度提高，顯著提高了土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌的數(shù)量。其中，對土壤中可培養(yǎng)微生物篩選的土壤浸提液濃度可低至10-7。有機(jī)培肥果園土壤中細(xì)菌的最佳篩選濃度為10-6和10-7，真菌的最佳篩選濃度為10-4和10-5。有機(jī)培肥對土壤中可培養(yǎng)放線菌的數(shù)量影響不顯著。

2.2? 果園土壤纖維素分解菌的篩選

以土壤懸濁液10-3濃度浸提液對纖維素分解菌進(jìn)行篩選（見圖1），通過篩選初步獲得10余株具有纖維素分解能力的菌株。通過對各菌株纖維素分解能力進(jìn)行測定（見表2），結(jié)果表明SM3-1和SM3-2兩菌株的纖維素分解能力最強(qiáng)，顯著高于其他菌株的分解能力，分別為3.83和3.55；其次為EM2-1、EM1-1和SM1-2，對纖維素的分解能力分別為2.43、2.33和2.06。

a：SM1土壤纖維素分解菌的篩選群落；b：SM3土壤纖維素分解菌的篩選群落；c：菌種SM3-1對纖維素的分解能力分析；d：菌種SM3-2對纖維素的分解能力分析。

2.3? 菌種的土壤養(yǎng)分活化能力鑒定

為進(jìn)一步驗(yàn)證各菌株的其他養(yǎng)分分解功能，通過固氮、無機(jī)磷溶解、有機(jī)磷溶解和解鉀培養(yǎng)基對已篩得菌株的進(jìn)行平板培養(yǎng)。結(jié)果表明（見表3），菌株SM1-1、SM1-2和EM2-2在無氮培養(yǎng)基上的生長勢顯著強(qiáng)于其他菌株，其具有較強(qiáng)的固氮能力。對于菌株對無機(jī)磷的溶解能力，則表現(xiàn)為除EM1-2、EM2-1和EM2-3之外，其他菌株的溶解無機(jī)磷能力均較強(qiáng)。而篩選出的菌株對有機(jī)磷的溶解能力均較強(qiáng)，其中EM2-3的溶解能力最弱。對于解鉀能力，菌株SM1-1、SM1-2、EM1-1、EM1-3和EM2-2的溶解能力較強(qiáng)，其他菌株的溶解能力均較為微弱。綜上可知，菌株SM1-1和SM1-2能夠有效溶解土壤中難溶性的養(yǎng)分，同時(shí)具有較強(qiáng)的固氮能力，是果園中優(yōu)質(zhì)的促生菌株。

2.4? 優(yōu)勢菌種的生物鑒定及形態(tài)觀察

通過革蘭氏染色法對SM1-1和SM1-2進(jìn)行顯微鏡觀察（見圖2），結(jié)果表明，SM1-1和SM1-2均為革蘭氏陽性菌，且均呈現(xiàn)桿狀。為了進(jìn)一步判定菌種的種屬，通過高通量測序后對菌種的DNA序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明SM1-1屬于熱羧基鏈霉菌屬（Streptomyces thermocarboxydus），SM1-2屬于枯草芽孢桿菌屬（Bacillus subtilis）。

3? 討論及結(jié)論

自由生活在植物根部或植物體內(nèi)的一系列能夠促進(jìn)植物生長發(fā)育的有益微生物為植物促生菌［10］。因此，選擇果園根際土壤進(jìn)行植物促生菌的提取是可取的。通過對不同果園根際土壤微生物進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同處理?xiàng)l件對果園根際土壤可培養(yǎng)微生物的數(shù)量及培養(yǎng)的稀釋濃度不盡相同。有機(jī)培肥能夠增加土壤中微生物的豐富度，但是減少了可培養(yǎng)微生物的數(shù)量，因此，有機(jī)培肥果園根際土壤的可培養(yǎng)微生物最佳篩選濃度為10-2、10-3。

在旱作條件下，增施有機(jī)肥、果園生草覆蓋或秸稈還田等措施能有效提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，增加土壤中養(yǎng)分的儲蓄［11］，改善土壤蓄水能力［12］。但是，生草覆蓋或秸稈還田后，在旱作條件下纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等的降解緩慢，是造成有機(jī)培肥后旱作土壤養(yǎng)分提高減慢的主要原因［13-14］，而纖維素分解菌則能有效促進(jìn)纖維素的分解與養(yǎng)分的釋放。因此，本研究從纖維素分解菌的分離純化入手，分別從5個(gè)處理的土壤中篩選出10株具有纖維素分解能力的菌體。而纖維素分解菌在纖維素培養(yǎng)基上產(chǎn)生水解圈的大小可以代表纖維素分解菌的分解能力，進(jìn)一步通過分解圈的測定發(fā)現(xiàn)，SM3-1和SM3-2菌株的纖維素分解能力最佳，分別為3.83和3.55。

在旱作條件的果園中，土壤養(yǎng)分的匱乏同樣是制約果樹產(chǎn)量與果實(shí)品質(zhì)的重要因素［15］。因而，具有固氮、解磷解鉀能力的菌株在有機(jī)培肥果園中則能發(fā)揮出更大的養(yǎng)分提升作用。通過進(jìn)一步對篩得菌株固氮、解磷和解鉀功能的分析，發(fā)現(xiàn)菌株SM1-2和SM1-1不僅具有纖維素分解能力，且同時(shí)具有良好的固氮、解磷和解鉀功能。因而，SM1-1和SM1-2是旱作果園有機(jī)培肥過程中友好的菌株。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，SM1-1和SM1-2均為革蘭氏陽性菌，進(jìn)而通過高通量測序鑒定兩菌分別為熱羧基鏈霉菌和枯草芽孢桿菌。

通過本試驗(yàn)得到兩株適合山西旱區(qū)果園有機(jī)培肥過程中，既能高效分解還田的纖維素物質(zhì)，同時(shí)能夠起到固氮、溶解土壤及有機(jī)肥中固定態(tài)無機(jī)磷、有機(jī)磷和鉀元素的菌株。本研究結(jié)果為山西有機(jī)旱作果園發(fā)展提供了微生物菌劑研發(fā)的原材料，能夠促進(jìn)旱作條件下有機(jī)果園的高效利用。

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