CD19+CD24hiCD38hi調節性B淋巴細胞在妊娠期高血壓疾病中的異常表達分析*

何 花,李詩雨,高 鷹,楊 林,任 為

(湖北省婦幼保健院產科,武漢 430070)

妊娠期高血壓疾病是妊娠與血壓升高并存的一組疾病,發生率為5%～12%[1]。其中,子癇前期是妊娠婦女20周以后出現高血壓和蛋白尿的妊娠特有全身綜合征,占妊娠婦女的5%～7%,嚴重影響母嬰健康,是導致孕產婦死亡、早產和圍生兒死亡的重要原因[2]。盡管對于妊娠期高血壓疾病發病機制、病因、預測及治療手段的研究很多,但其具體發病機制至今尚未完全闡明。越來越多的研究表明,B淋巴細胞主導的體液免疫同樣在子癇前期的致病機制中起著重要作用[3]。而近年來,學者們在B淋巴細胞群中發現了一類具有免疫反應負向調節作用的B淋巴細胞亞群,將其稱為調節性B淋巴細胞,作為負性調節細胞,其功能主要依賴于分泌的大量抑制性細胞因子,在抑制炎癥免疫反應、維持/誘導調節性T淋巴細胞功能及阻止自身免疫反應等方面均具有調節作用[4]。本研究為了提供更多CD19+CD24hiCD38hi調節性B淋巴細胞參與妊娠期高血壓疾病的證據,擬通過檢測孕婦血清CD19+CD24hiCD38hi調節性B淋巴細胞及其分泌的相關細胞因子白細胞介素-10(IL-10)的表達來了解其在妊娠期高血壓疾病發生、發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020年9月至2021年5月于本院就診的孕婦信息。妊娠期高血壓疾病孕婦的納入標準:(1)孕前檢查、定期產檢及分娩均在本院;(2)有完整的孕期血壓數據,符合《妊娠期高血壓疾病診治指南(2020)》[5]診斷標準;(3)終止妊娠前經孕婦同意采集并留存有外周血。排除標準:(1)孕前存在高血壓、糖尿病、自身免疫性疾病等內外科合并癥病史;(2)存在高血壓家族史;(3)分娩前有其他產科并發癥及合并癥;(4)無完整的孕前檢查、定期產檢及分娩時的血壓數據。最終納入符合標準的孕婦26例,并將其分為妊娠期高血壓組(15例)、子癇前期組(11例)。另選取同期正常妊娠孕婦12例作為對照組,整個孕期血壓均正常,分娩前無其他產科并發癥及合并癥,孕前無高血壓、糖尿病、自身免疫性疾病等內外科合并癥病史。本研究得到了本院倫理委員會的批準([2022]IEC118號)。

1.2 方法

1.2.1取血樣

在終止妊娠前,采用乙二胺四乙酸(EDTA)真空管采集3組孕婦血液,并在1 h內進行處理。

1.2.2流式細胞術檢測B淋巴細胞

取100 μL抗凝血置于流式管底部;加入流式抗體CD19、CD24、CD38(每個抗體每管加5 μL),渦旋混勻后4 ℃避光孵育20 min;加入2 mL溶血素,渦旋,置于室溫避光15 min;每隔5分鐘觀察1次,若變成透明的紅色則立刻進行下一步。每管加入2 mL Stain上樣緩沖液,1 100 r/min離心5 min,棄上清液;再加入2 mL Stain上樣緩沖液后渦旋,1 100 r/min離心5 min,棄去上清液;加入400 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞,上流式細胞儀檢測并分析數據。

1.2.3流式細胞術檢測細胞因子

(1)制備細胞因子標準品:將1瓶凍干的細胞因子標準品小球轉移至15 mL錐形離心管中,標記為最高濃度標準品(5 000 pg/mL);用2 mL Assay Diluent稀釋標準品,室溫平衡至少15 min;用槍頭輕柔混勻標準品;取9支12×75 mm流式管,分別標記梯度稀釋倍數1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256;每管加入500 μL Assay Diluent;從最高濃度標準品開始逐個加入500 μL倍比稀釋液,梯度稀釋標準品(從最高濃度標準品管取500 μL溶液至1∶2管,吹打混勻,隨后從1∶2管取500 μL溶液至1∶4管,吹打混勻,以此類推,直至1∶256管),最后取1支12×75 mm流式上樣管加入500 μL Assay Diluent作為陰性質控管(0 pg/mL)。(2)混合細胞因子捕獲微球:確定樣品數,混合前每種捕獲微球需Vertex充分渦旋5～15 s,按照每個樣品7 μL吸取適量的捕獲微球,充分渦旋混勻。(3)樣品孵育:充分渦旋重懸混合微球,每個實驗管加入50 μL混合微球,再加入50 μL藻紅蛋白(PE)標記的細胞因子檢測抗體,室溫避光孵育3 h。(4)上機檢測:每管加入1 mL洗液清洗樣品,1 100 r/min離心5 min,小心吸去或輕柔倒掉上清液,每管加入300 μL洗液重懸細胞,儀器調校完畢后盡快上機檢測。

1.3 統計學處理

采用GraphPad Prism6軟件進行統計分析,非正態分布計量資料以M(Q1,Q3)表示,多組間比較采用Kruskal Wallis檢驗,兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗;檢驗水準α=0.05,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組一般資料比較

3組年齡、孕次、產次及BMI比較,差異均無統計學意義(P>0.05),見圖1。

A:3組年齡比較;B:3組孕次比較;C:3組產次比較;D:3組BMI比較。

2.2 3組CD19+B淋巴細胞的表達

3組血清CD19+B淋巴細胞百分比:對照組>子癇前期組>妊娠期高血壓組,但3組間比較差異無統計學意義(P>0.05),見圖2。

A:3組CD19+B淋巴細胞百分比比較;B～C:流式細胞術分析CD19+B淋巴細胞在對照組、妊娠期高血壓組及子癇前期組中的表達。

2.3 3組CD19+CD24hiCD38hi調節性B淋巴細胞的表達

3組血清CD19+CD24hiCD38hi調節性B淋巴細胞百分比比較,差異有統計學意義(P<0.05);兩兩比較顯示:對照組>妊娠期高血壓組>子癇前期組,且對照組與妊娠期高血壓組、子癇前期組有明顯差異(P<0.05),妊娠期高血壓組與子癇前期組無明顯差異(P>0.05),見圖3。

A:3組CD19+CD24hiCD38hi調節性B淋巴細胞百分比比較;B～D:流式細胞術分析CD19+CD24hiCD38hi調節性B淋巴細胞在對照組、妊娠期高血壓組及子癇前期組中的表達;a:P<0.05。

2.4 3組血清IL-10的表達

3組血清IL-10表達水平:妊娠組>妊娠期高血壓組>子癇前期組,且兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05),見圖4。

a:P<0.05。

3 討 論

妊娠期高血壓疾病是妊娠期特有的一組疾病,其中子癇前期以妊娠20周后出現高血壓、蛋白尿和水腫為特征。子癇前期經治療母胎狀況沒有改善或病情持續進展時,終止妊娠是最有效的治療措施,因此在確定發生原因方面取得的研究進展有限[6]。目前,子癇前期的病理生理機制尚未明確,胎兒-母親耐受性障礙和免疫穩態的改變被廣泛認為是其發生的主要機制。已有大量證據表明,免疫細胞在子癇前期的發生、發展中發揮作用[7-8]。正常妊娠期間,植入后不久母胎界面出現強化的免疫浸潤,以自然殺傷細胞為主(占蛻膜淋巴細胞總數的70%),其次是巨噬細胞(占20%)、T淋巴細胞(占10%～20%)和罕見的樹突狀細胞和B淋巴細胞[9]。其中B淋巴細胞是免疫反應的謹慎協調者,這對維持胎兒-母體的耐受性至關重要。調節性B淋巴細胞是一種具有免疫調節功能的B淋巴細胞亞型,對人體健康和疾病有多種影響,其通過各種細胞因子(如IL-10、IL-35)及細胞表面標志物的表達發揮免疫耐受和調節作用[10]。

研究發現,CD19+B淋巴細胞水平在正常妊娠或子癇前期患者中沒有變化[11],這與本研究結果相似。在本研究中妊娠期高血壓組孕婦血清CD19+B淋巴細胞也處于相對穩定狀態。此外,本研究中妊娠期高血壓組及子癇前期組孕婦CD19+CD24hiCD38hi調節性B淋巴細胞百分比明顯低于對照組。BLAIR等[12]研究表明,人外周血中可分泌IL-10的CD19+CD24hiCD38hi調節性B淋巴細胞百分比最高。ROLLE等[13]發現調節性B淋巴細胞在正常妊娠的前3個月增強,可能通過產生抗炎因子IL-10抑制炎癥反應,有助于妊娠耐受環境的建立。在本研究中,相較于對照組,妊娠期高血壓組及子癇前期組孕婦外周血血清IL-10水平降低。

已有研究表明,調節性B淋巴細胞可能通過調節輔助性T淋巴細胞(Th)亞群Th1/Th2和Th17/調節性T淋巴細胞(Treg)細胞平衡,在子癇前期的發生中發揮作用[14]。調節性B淋巴細胞可誘導初代T淋巴細胞分化為Th1和Th17。它們還可以通過調節樹突狀細胞分泌細胞因子來影響Th1和Th17的分化。此外,調節性B淋巴細胞還能分泌抑制性細胞因子,如IL-10、IL-35和抑制性抗體[15]。其中,IL-10被證明在子癇前期中失調,且其表達水平在疾病活動期降低[15]。這表明子癇前期的全身炎癥反應和內皮功能障礙可能與IL-10缺乏相關,并最終導致免疫調節、促炎環境和血管生成受損。臨床上,靶向IL-10的治療方法可能為子癇前期提供新的選擇。

在各種子癇前期動物模型中也類似地證明了IL-10途徑的失調[16-19]。此外,在子癇前期動物模型中使用重組IL-10可改善子癇前期癥狀,并且沒有其后代發生不良反應的報道[20-21]。這為IL-10用于子癇前期治療的可能性提供了依據。重組IL-10安全且耐受性良好,雖然在人體中的使用可能因半衰期短而受到限制,但對于IL-10水平較低的子癇前期患者,IL-10藥物遞送系統的研究可能具有重要意義。

綜上所述,孕婦外周血CD19+CD24hiCD38hi調節性B淋巴細胞及其分泌的IL-10改變可能與妊娠期高血壓的發生有關,利用圍產期免疫調節特性來調節B淋巴細胞的激活和功能,可能會成為一種新的治療方案。