惡性黑色素瘤中CD8及Foxp3的表達與PD-1抑制劑治療療效的關系

鄒平安 陶志偉 楊崢旭 劉 哲 廖建玉

對于晚期惡性黑色素瘤患者,PD1免疫治療已成為指南推薦的首選治療,PD-1抑制劑能夠更好地隔斷PD-1 受體同 PD-L1 配體的之間的融合,幫助免疫細胞識別腫瘤細胞,由此提升機體自我的免疫水平,最終達到治療目的,但是,有數據顯示PD-1抑制劑在中國惡性黑色素瘤患者中的客觀緩解率僅有20%[1],因此臨床上亟需找到影響PD1抑制劑療效的相關因子。本研究選取經PD-1抑制劑治療的惡性黑色素瘤患者,通過免疫組化檢測CD8及Foxp3的表達,分析其與惡性黑色素瘤PD1抑制劑療效(客觀控制率與無進展生存期)的相關性,初步探討其作為療效的生物標志物可能性。

1 資料與方法

1.1 患者納入標準

選取本院2019年1月年至2021年6月轉移的或不可切除的惡性黑色素瘤患者共54例,在我院確診且均留有手術標本蠟塊,其中男性30例,女性24例,中位年齡62歲。給予所有患者PD-1抑制劑特瑞普利單抗240 mg 靜滴,每2周一次,至少用藥3個月(排除假性進展)。至少有一處可評估的病灶。隨訪周期至少1年以上,或隨訪至病情進展。失訪或不能耐受藥物毒副作用的患者排除。

1.2 PD-1抑制劑療效評估及繪制無進展生存曲線

收集納入標準患者的病歷、病理數據和影像學信息,圍繞符合要求的病患展開訪查活動,參照實體瘤評估要求recist1.1對效果進行評價,主要包含:CR:病灶徹底緩和,排除結節性疾病,目標病灶均被徹底的消除了。全部的目標結節須均降低至常規水平(短軸<10 mm)。PR:病灶有效緩和,全部可測的目標病灶的直徑其總值小于基線不低于30%。目標結節總和應用短徑,但是其他的目標病灶總和則選擇最長直徑。PD:疾病發展,圍繞整個的測試期間全部的檢測的靶病灶直徑總值的最低值為依據,直徑和相對而言提高不低于20%,與此同時,務必達到直徑和的絕對值提高不低于5 mm。SD:病情穩定,靶病灶降低水平未有達到PR,提高的水平也未有達到PD水平,存在于這兩者之間,分析過程中可選擇直徑之和的最低值進行對比。PFS:無進展生存階段,病患自接納治療伊始,至發現疾病進展或可能出現由于其他方面的因素而死亡的整個周期。

根據以上標準評估療效,用SPSS軟件繪制患者總體的無進展生存曲線。

1.3 免疫組化檢測CD8及Foxp3的表達

在10%的福爾馬林中對手術標本進行固定處理,并選擇石蠟予以包埋處理,4 μm切片處理,En Vision 法免疫組織化學染色。石蠟切片常規脫蠟水化處理,FOXP3和CD8則選擇檸檬酸鹽緩沖液熱抗原予以修復處理,組織切片浸潤在3%的雙氧水室溫條件下遮光培育20 min,給單內源性過氧化物酶活性。依次引入Foxp3(1∶100)和CD8(1∶100)一抗50 μl,濕盒四度培育12 h。加入二抗增強劑,濕盒培育20 min,引入常規的二抗,濕盒室溫條件下培育半小時。DAB著色,蘇木精復染返藍,普通酒精梯度脫水處理、二甲苯透明以及光學顯微鏡條件下進行分析。選擇IgG陰性進行參照處理。

結果判定:由兩位具備專業水平的病理科醫療人員,根據雙盲法的原則對結果予以判定。Foxp3根據細胞核內存在棕黃色以及棕褐色著色判定為陽性,CD8則是細胞膜產生棕黃色以及棕褐色著色判定是陽性。每個標本于顯微鏡下隨機選取10個四百倍的視野,各個視野計數一百個細胞內陽性細胞數,依次選擇均值來確定切片的Foxp3以及CD8具體數目。各個切片Foxp3數目高于5個則判定陽性,不高于5個則判定陰性;除此之外,各個切片CD8數目高于10個則判定陽性,不高于10則判定陰性。

1.4 統計方法

涉及的數據選擇SPSS 22.0應用進行處理,計數數據采取百分數的形式表示,并進行卡方校驗,選擇Spearman秩相關校驗。無進展生存時間分析則采取Kaplan-Meier法以及Log-rank檢驗,P<0.05則數據差異存在統計學意義。

2 結果

2.1 CD8及Foxp3在惡性黑色素瘤組織中表達情況

54例惡性黑色素瘤組織里,CD8表達陽性28例,占51.85%;Foxp3表達陽性22例,占40.74%。

2.2 CD8及Foxp3的表達與PD1抑制劑近期療效的關系

54例黑色素瘤病患,經PD1抑制劑干預之后,在隨訪周期內,26例進展,2例完全緩解、8例不完全緩解、18例穩定,總的疾病控制率為51.85%。CD8陽性表達患者中疾病控制率(DCR%)為78.58%,CD8陰性表達患者中疾病控制率為23.08%,CD8陽性表達患者疾病控制效果顯著好于陰性患者(P值<0.05)。在Foxp3陽性表達患者中疾病控制率為36.36%,CD8陰性表達患者中疾病控制率為62.50%,Foxp3陽性表達者疾病控制率明顯低于陰性表達者(P<0.05),見表1。

表1 PD1抑制劑的疾病控制率與CD8、Foxp3表達相關分析(例,%)

2.3 CD8及Foxp3的表達與惡性黑色素瘤患者生存期的關系

54例惡性黑色素瘤患者經PD1抑制劑干預之后,中位PFS是10個月,12個月無進展生存率達到46%,2年無進展生存率為26%。如圖1。其中,CD8陽性病患中位PFS達到1年,CD8陰性病患的中位則達到8個月,CD8陽性的病患無進展生存周期顯著要大于CD8陰性病患,兩者差異具有統計學意義(P=0.013<0.05)。見圖2。Foxp3陽性病患的中位PFS達到8個月,陰性病患的中位PFS則達到1年,Foxp3陽性病患的無進展生存周期顯著小于陰性病患,差異性十分顯著(P=0.011<0.05),見圖3。

圖1 PD1抑制劑治療總體的無進展生存期

圖2 CD8陽性與CD8陰性患者的無進展生存曲線

圖3 Foxp3陽性與Foxp3陰性患者的無進展生存曲線

3 討論

惡性黑色素瘤組織內,CD8表達和惡性黑色素瘤的生存時間有著極大的聯系,可能與CD8 T淋巴細胞直接殺傷腫瘤細胞有關[2]。國外有研究顯示,CD8在黑色素瘤中的表達的數量以及空間分布與免疫治療應答呈正相關[3]。血液中循環CD8 T淋巴細胞的類型可以預測PD-1抑制劑治療的療效[4]。有實驗證明CD8 T淋巴細胞的功能失調將導致PD-1抑制劑的耐藥[5]。在肺癌患者中,血液中CD8細胞數量缺失與PD-1抑制劑的治療進展相關[6]。Foxp3為叉頭樣轉錄因子家族主要組成之一,特異性表達于Tregs,另外和Tregs的發育以及免疫抑制的發揮有著重要聯系。Tregs是關鍵的免疫調節細胞,有關研究說明,惡性黑色素瘤內Tregs細胞浸潤情況和病患的預后為反向聯系[7]。皮膚惡性黑色素瘤內,Foxp3陽性的T淋巴細胞參與了腫瘤的免疫逃避,從而導致病變進展[8]。FOXP3可能是黑色素瘤的有用治療靶點,因為抑制FOXP3陽性腫瘤克隆和調節T細胞可以消除腫瘤細胞逃避宿主免疫防御的能力[9]。國外有研究表面在轉移性惡性黑色素瘤細胞中,Foxp3的表達明顯增高,可以作為惡性黑色素瘤進展的潛在生物標志物[10]。在腫瘤浸潤淋巴細胞中,CD8+及Foxp3+可以作為惡性黑色素瘤的預后的生物標志物[11]。

我國的有關研究提到,惡性黑色素瘤內,腫瘤位置的差異性、Foxp3+Treg以及CD8+T的數目,是否遠端轉移的惡性黑色素瘤病患的PFS都不一樣。Tregs數和惡性黑色素瘤的進展高度關聯,黏膜惡性黑色素瘤預后不理想或許和Tregs浸潤有著聯系[12]。此次探究,PD-1抑制劑對54例惡性黑色素瘤患者的總體疾病控制率為51.85%,中位PFS為10個月。而CD8陽性病患的疾病管控水平和生存期都要比CD8的陰性病患更理想,Foxp3陰性病患的疾病管控水平和生存期都要比陽性病患更理想,CD8的表達和PD-1抑制劑的應用之間為正向關系,而Foxp3的表達則與其之間為負反饋關系,下一步有望通過提高CD8的表達及降低Foxp3的表達建立更為理想的腫瘤免疫微環境,提升PD-1的免疫治療水平。