CMTM6和PD-L1在宮頸鱗癌組織中的表達及臨床意義

馬 艷 李隆玉 敖梅紅 盧朝霞

宮頸鱗癌占宮頸癌75%～80%,惡性程度高、發病率和死亡率高[1-2]。盡管宮頸癌篩查不斷普及、手術與放療技術不斷進步、化療藥物不斷更新,但宮頸癌的發病與死亡人數仍呈現出增長趨勢[3]。目前宮頸癌以手術治療和放療為主,并輔以化療。近年來免疫治療是宮頸鱗癌新的研究熱點,其中研究人員對程序性死亡配體1(Programed CellDeathLigand-1,PD-L1)和趨化素樣因子超家族蛋白6(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing 6,CMTM6)尤為關注。然而,有關CMTM6和PD-L1在宮頸鱗癌中表達的研究較少。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2015年1月至2016年12月江西省婦幼保健院病理科存檔的滿足實驗條件的石蠟包埋組織,實驗組納入標準:我院初診,2009年國際婦產科聯盟(international Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)臨床分期為Ⅰa～Ⅱa 期早期宮頸鱗癌患者,行宮頸癌根治術,經組織病理學確診;沒有合并其他系統的癌癥;術前未接受放射及化學藥物治療;無高血壓及心血管疾病;進行過5年生存情況隨訪;資料完整。對照組納入標準:入組患者為同期住院,年齡與實驗組無明顯差異,正常宮頸組織來源于因子宮良性病變(如子宮肌瘤)行全子宮切除的病例,宮頸癌前病變為行宮頸錐切術的病例。全部病例經組織病理學診斷證實,臨床確診;既往無癌癥史,無高血壓及心血管疾病。本研究已經獲得醫院倫理委員會的審查和批準。

患者隨訪主要是通過查閱病歷及電話聯系,隨訪終點為患者手術日至疾病復發或(因任何原因)死亡,或隨訪時間滿5年。最終實驗組共納入宮頸癌組織46例,對照組中宮頸癌前病變組織26例,正常宮頸組織20例。

1.2 方法

免疫組化染色:將石蠟包埋組織連續切片,常規脫蠟,微波抗原修復,滴加稀釋好的一抗,室溫放置1 h后放入4 ℃恒溫箱中孵育過夜,加入酶標二抗37 ℃孵育1 h,滴加現配的DAB顯色劑,蘇木精復染2 min,脫水,封片、晾干,顯微鏡檢。

1.3 結果判斷

首先,在低倍顯微鏡下觀察整個切片,并選擇表達最多的區域,當細胞質或細胞膜中呈現黃色至棕褐色時,呈陽性染色,結果判斷標準[4],陽性細胞的染色強度分為:0分為無染色,1分為淺黃色,2分為棕黃色,3分為棕褐色。陽性細胞密度的分級如下:陽性細胞數<10%為1分,10%～50%為2分,>50%為3分,兩個分數相乘的結果≥3分為陽性,即高表達。

1.4 統計分析

用SPSS 26.0建立數據庫并進行數據分析,計量資料用t檢驗,計數資料用χ2檢驗,采用McNemar檢驗差異性,Kappa檢驗一致性,用Kaplan-Meier曲線分析生存時間,P<0.05表示差異有顯著性。

2 結果

2.1 一般情況

宮頸鱗癌組年齡(48.24±8.12)歲,癌前病變組年齡(49.35±10.78)歲,正常宮頸組年齡(48.92±9.78)歲,三者年齡差異無顯著性,t=2.253,P>0.05。宮頸鱗癌Ⅰa期3例、Ⅰb期31例、Ⅱa期12例;宮頸鱗癌伴有盆腔淋巴結轉移15例,無盆腔淋巴結轉移31例;有脈管癌栓29例,無脈管癌栓17例;有宮旁浸潤7例,無宮旁浸潤39例。

2.2 CMTM6、PD-L1在3組組織中的表達

CMTM6在正常宮頸、癌前病變和宮頸鱗癌組織中高表達分別為0%、11.54%、60.87%,PD-L1在3組高表達分別為10.00%、15.38%、71.74%,CMTM6和PD-L1在宮頸鱗癌中表達增高,差異有極顯著性(見表1)。進行組間分析,CMTM6和PD-L1在宮頸鱗癌組織中的高表達都顯著高于癌前病變組織(χ2=31.081,P=0.00;χ2=32.581,P=0.00),差異有極顯著性;而CMTM6和PD-L1在正常宮頸和癌前病變組織中高表達都無顯著性差異(fisher's精確檢驗,P值分別為0.246、0.684)。結果進一步說明CMTM6和PD-L1在正常宮頸和癌前病變少有高表達,而在宮頸鱗癌中表達增高。

表1 CMTM6和PD-L1在正常宮頸、癌前病變和宮頸鱗癌組織中的表達(例,%)

2.3 CMTM6、PD-L1表達在宮頸鱗癌中的相互關聯

采用McNemar檢驗兩者差異性,提示CMTM6、PD-L1表達在宮頸鱗癌中差異無顯著性(P=0.227);Kappa檢驗兩者一致性,提示CMTM6、PD-L1表達在宮頸鱗癌中呈一致性(P=0.001,Kappa值為0.472),提示CMTM6和PD-L1的表達在宮頸鱗癌中密切相關。見表2。

表2 CMTM6和PD-L1表達在宮頸鱗癌中的相互關聯/例

2.4 CMTM6、PD-L1表達與宮頸鱗癌分期情況

在早期宮頸鱗癌中,CMTM6、PD-L1表達與早期宮頸鱗癌FIGO分期無明顯關聯。見表3。

表3 CMTM6、PD-L1表達與宮頸鱗癌分期情況/例

2.5 CMTM6、PD-L1表達與宮頸鱗癌浸潤、轉移情況

宮頸鱗癌患者出現脈管癌栓、宮旁浸潤、淋巴轉移時,CMTM6表達增高;但PD-L1高表達與宮頸鱗癌脈管癌栓、宮旁浸潤、淋巴轉移無明顯關聯(P>0.05)。見表4。

表4 CMTM6表達與宮頸鱗癌浸潤、轉移情況/例

2.6 CMTM6、PD-L1表達與早期宮頸鱗癌患者5年DFS的關系

通過Kaplan-Meier分析,CMTM6高表達組5年DFS均值為(46.04±3.70)月,低表達組均值為(56.89±2.17)月,Log Rank整體比較,P=0.04,2組整體的生存情況存在顯著性差異,繪制2組生存曲線(圖1),從生存曲線可見,CMTM6低表達組的5年DFS要高于CMTM6高表達組。PD-L高表達組5年DFS均值為(49.76±3.27)月,低表達組均值為(51.62±3.32)月,Log Rank整體比較,P=0.51,2組整體的生存情況無顯著性差異,繪制2組生存曲線(圖2),從生存曲線可見,PD-L1高表達和低表達組的5年DFS無顯著差異。

圖1 CMTM6表達與CSCC患者5年生存分析

圖2 PD-L1表達與CSCC患者5年生存分析

3 討論

宮頸癌是影響女性生殖系統健康的主要惡性腫瘤之一,危害非常大,因此針對宮頸癌的病因、診斷、治療等方面的研究從未停止。目前,宮頸癌的主要治療方法有手術、放療或化療,但部分宮頸癌的治療效果和預后較差,這些療法尤其對復發或轉移性宮頸癌患者的收益有限。因此,探索治療宮頸癌的新方法,尋找宮頸癌的新分子靶點,對宮頸癌患者的治療和生存率提高具有重要意義。

程序性死亡受體1(programmed cell death proteinl,PD-1)為活化T淋巴細胞上的誘導型基因,可以介導各種腫瘤細胞的免疫逃逸,PD-1/PD-L1是一對重要的負性共刺激分子,在免疫系統中抑制免疫反應、調節免疫耐受和維持免疫平衡。PD-L1在許多類型的腫瘤組織中表達是上調的,而在癌旁組織和正常組織中表達較低,甚至不表達。有研究結果顯示[5]PD-L1在宮頸癌組織中的陽性表達率為 81.3%,本研究發現PD-L1在正常宮頸、癌前病變和宮頸鱗癌組織中高表達分別為10%、15.38%、71.74%,隨著病理分級的增加,PD-L1的高表達逐漸增加。徐苗[6]的研究結果也顯示隨著PD-L1表達增加宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)等級隨之增加。PD-L1在多種腫瘤細胞都有表達,包括肺癌、口腔鱗癌等。PD-L1通過與PD-1結合,抑制T細胞遷移、增殖,以達到腫瘤免疫逃逸[7]。近年來PD-l/PD-L1信號通路在腫瘤治療領域受到了廣泛關注 。有研究表明[8]PD-l/PD-L1信號通路與乳腺癌的發生、發展及預后密切相關,PD-l/PD-L1抑制劑在乳腺癌中具有良好的抗腫瘤活性[9]。PD-L1在腸癌中高表達,且PD-L1 陽性表達與較短的總體生存期相關[10-11]。抗PD-L1抗體可以治療黑色素瘤、腎細胞癌、肺癌,結腸癌,頭頸部腫瘤和胃癌等人類癌癥。Kim等研究顯示[12-13],宮頸鱗癌組織中PD-L1的高表達,與腫瘤發生發展、腫瘤浸潤深度有關。Rotman等[14]指出宮頸癌患者淋巴結轉移與PD-L1表達升高相關,認為 PD-L1 的陽性表達對宮頸癌的發生、發展與轉移有一定作用。而本研究PD-L1高表達與宮頸鱗癌臨床分期、脈管浸潤、宮旁浸潤、淋巴轉移無明顯關聯,這可能與所選病例均為早期宮頸癌有關。Gibney等[15]認為PD-L1的表達不影響晚期宮頸癌患者的生存期,本研究結果亦表明早期宮頸癌患者PD-L1高表達和低表達組的5年DFS無顯著差異。

PD-L1在腫瘤組織中特異性地高表達,使其成為了腫瘤免疫治療的靶點。目前,美國食品藥品監督管理局批準了5種抗PD-1/PD-L1抗體用于宮頸癌的治療。但單一的免疫治療并不敏感,PD-1/PD-L在宮頸癌的緩解率為13.3%～26.3%[16],因此聯合免疫治療至關重要。

CMTM6 是趨化素樣因子超家族成員,在腫瘤細胞免疫逃逸和免疫抑制中有著非常重要的作用。CMTM6在多種癌癥中均有異質性表達[17]。本研究發現CMTM6在正常宮頸、癌前病變和宮頸鱗癌組織中高表達分別為0%、11.54%、60.87%,CMTM6的陽性表達隨病理級別的升高而逐漸升高。CMTM6的表達與年齡、臨床分期無關,而宮頸鱗癌患者出現脈管癌栓、宮旁浸潤、淋巴轉移時,CMTM6表達增高。Kaplan-Meier分析表明宮頸鱗癌患者CMTM6低表達組的5年DFS要高于CMTM6高表達組,CMTM6高表達的宮頸鱗癌患者生存期更短、預后更差。CMTM6在肺鱗癌的高表達與較差的無復發生存期顯著相關[18]。CMTM6過表達預示頭頸部鱗狀細胞癌患者預后不良[19]。胃癌[20-21]腫瘤組織中CMTM6高表達,且患者預后較差。CMTM6表達與原發性肝癌(hepatic cell carcinoma,HCC)的轉移相關,CMTM6陽性組與CMTM6陰性組HCC患者的生存時間存在差異。而在肺腺癌[22]CMTM6高表達的患者生存期較好。非小細胞肺癌(non-small-cell carcinoma,NSCLC)CMTM6高表達與NSCLC患者預后較好相關[23]。CMTM6在結直腸癌(colorectalcancer,CRC)中表達上調,預示著CRC患者預后良好[24]。這些均表示在不同類型的腫瘤中CMTM6可能有不同的表達和不同的調節。

CMTM6是PD-L1的關鍵調控因子[25],能夠促進PD-L1的表達,特異性保護PD-L1免受降解。在黑色素瘤中CMTM6的表達與PD-L1在蛋白水平和mRNA水平均呈正相關,CMTM6和PD-L1的高表達與患者的較長生存期顯著相關[26]。CMTM6與PD-L1共表達的粗梁實體型肝癌(macrotrabecular-massive subtype of hepatocellular carcinoma,MTM HCC)患者發生進展和死亡的風險更高。CMTM6與PD-L1共表達對HCC患者,特別是MTM HCC患者的預后有不良影響[27-28]。在肺鱗癌(lung squamous carcinoma,LUSC)患者中,CMTM6與PD-L1在mRNA和蛋白水平上呈正相關[29-30]。胃癌組織中CMTM6的表達與PD-L1的陽性表達顯著相關[31]。本研究的McNemar檢驗提示CMTM6、PD-L1表達在宮頸鱗癌中差異無顯著性,Kappa檢驗提示CMTM6、PD-L1表達在宮頸鱗癌中呈一致性,提示CMTM6和PD-L1的表達在宮頸鱗癌中密切相關。目前PD-l/PD-L1靶向治療是宮頸癌的重要治療方法之一,因此,CMTM6也有可能成為宮頸癌靶向治療的新靶點。

綜上可知,CMTM6和PD-L1在早期宮頸鱗癌患者中表達增高,對診斷和個性化治療有重要的臨床意義。CMTM6可作為早期宮頸鱗癌浸潤、轉移預警及生存預后的評價指標。

然而,本研究樣本量較小且局限于早期宮頸鱗癌,期望能進一步擴大研究范圍,包含宮頸癌不同病理類型、各個期別的大樣本或多中心研究,建立CMTM6與PD-L1表達對宮頸癌診斷和預后模型,幫助臨床醫生選擇更有效的宮頸癌治療方法及準確評估預后。